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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酵母质粒转化及提取验证问题求助
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 酵母质粒转化及提取验证问题求助

最近需将穿梭质粒转入啤酒酵母W303内，用化学法（醋酸锂）转化，URA选择性平板培养数日后终于出现阳性菌落。为了鉴定阳性转化子是否转入质粒，我挑了阳性菌落，用酵母质粒抽提试剂盒提取了质粒，用这个质粒转入DH5alfa（50ul感受态细胞，5ul质粒），但平板上没有阳性菌落。随后又重复转DH5alfa（100ul感受态细胞，10ul质粒），仍无阳性转化子。现在不知道该怎么办了，求助各位~
现在问题很多，很乱：
1，转DH5a失败原因可能在转化操作，也可能是质粒的问题。因为之前老外邮寄过来的质粒就是先在DH5a里扩增的，因此前者可排除。所以就是质粒出了问题。
2，质粒的问题有二：要么根本没转进酵母，要么试剂盒没提出质粒。
3，要想验证问题2，是应该做PCR验证还是直接将酵母里提出的质粒测序？
4，酵母质粒抽提时候，摇菌条件对质粒影响大吗？试剂盒说明上说过度培养会使ＤＮＡ降解；坛子里有虫子说要酵母菌液１０ｍｌ，那最后洗脱使用洗脱剂体积多少合适？

先谢过各位了～
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1楼 2011-05-26 15:17:31
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2011-05-28 13:22:27:
你用一个原来转进酵母的质粒作对照转DH5a，就可以知道你的问题是感受态的问题还是酵母提取质粒试剂盒的问题。
你还可以通过PCR来验证你是否提取酵母质粒成功。如果以你提取的酵母质粒PCR都没条带，那么几乎可以肯 ...

那我提出来的酵母质粒不做PCR直接送去测序可以吗？测序公司测序时候不都是也要PCR扩增的吗？之所以这么问是因为我测序一个样才几十块钱，要是做PCR还得买原料还得合成引物，费时又费钱....
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9楼2011-05-28 19:25:36
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
没有做酵母的虫子吗
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2楼2011-05-26 20:09:54
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
3楼2011-05-27 10:12:41
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deblway

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

baby1_9253344(金币+2): 2011-05-27 15:57:11
额。。感觉上咋跟我理解的不一样呢。。穿梭质粒是在DH5a中扩增的，您的质粒是应该线性化后再转入酵母菌中进行同源重组吧。。。筛选的应该是拷贝数较高的菌株！没太明白如何从酵母菌中提取转染进的线性质粒？可能是我孤陋了。。据我所知是无法从已经转染过后的酵母菌种提取质粒的吧。。。
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海贼王！哥当定了。。。。
4楼2011-05-27 14:57:56
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