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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助：5.5KPCR片段连接难，请教！！
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xiaojing459

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助：5.5KPCR片段连接难，请教！！

求助：我的片段约5.5 K, 连接到pGEM-T载体上，老是连接失败，挑不到阳性克隆，麻烦有经验的帮我想想办法，提些建议，多谢！
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1楼 2011-03-31 21:09:08
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)
★
xiaojing459(金币+3):谢谢参与
看看 是不是犯了低级错误
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2楼2011-03-31 21:27:57
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soarfalcon8808

铁杆木虫 (职业作家)
★
xiaojing459(金币+3):谢谢参与
可能操作上有点小问题
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3楼2011-03-31 22:05:25
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
xiaojing459(金币+3):谢谢参与
dhd997(金币+2): good 2011-04-01 08:46:26
当时连过4K+的也没成功，不知道是不是T载承载能力不够的原因。
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4楼2011-03-31 22:15:09
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
xiaojing459(金币+3):谢谢参与
dhd997(金币+3): good 2011-04-01 20:01:27
1、连个小片段，做阳性对照，片段不是pfu扩增的吧？
2、延长连接时间到16hours
3、在连接了8hour后加点atp和酶
试试看行不行
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5楼2011-04-01 09:46:11
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
xiaojing459(金币+3):谢谢参与
dhd997(金币+3): good 2011-04-02 08:15:25
连小片段做阳性对照证明试剂没问题，长片段是很难练，在体系中加大片段浓度，增加延长时间
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6楼2011-04-01 14:47:58
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这么长的片段做ta克隆是很难连上的
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7楼2011-04-01 14:52:33
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yehuanren

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+6): good 2011-04-01 20:01:39
我前段时间也做了，pcr用的酶是 LA tag，用的是promega公司的 PGEM-Teasy 载体。转化大肠杆菌后倒是能长出慢慢的 蓝白斑。挑单菌落后提质粒，电泳检测每个质粒有好多条带，不知道为什么。拿了一管菌液去测序了。还不知道结果如何。
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8楼2011-04-01 18:18:55
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yehuanren

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+3): good 2011-04-02 08:15:48
T载体1微升，buffer 5微升，T4 DNA 连接酶 1微升，剩下的都加pcr产物，不加dd水
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9楼2011-04-01 18:22:03
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yehuanren

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
T载体1微升，buffer 5微升，T4 DNA 连接酶 1微升，剩下的都加pcr产物，不加dd水。总共10微升。
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10楼2011-04-01 18:54:09
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wangleisdnu

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by xiaojing459 at 2011-03-31 21:09:08:
求助：我的片段约5.5 K, 连接到pGEM-T载体上，老是连接失败，挑不到阳性克隆，麻烦有经验的帮我想想办法，提些建议，多谢！

try electro-transformation, it will help you a lot
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11楼2011-04-01 20:21:07
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gujinhai8802

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 感谢交流 2011-04-02 12:30:42
在连接体系中片段和载体的浓度加起要大于100ng
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12楼2011-04-02 08:53:17
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bioxy

木虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+5): good 2011-04-02 12:30:54
pGEM-T载体本身才3 kb，接近载体本身大小或者大于载体的片段连上的难度较大。如果实在连不上，你可以考虑在PCR引物上设计酶切位点加上保护碱基，PCR完成后做酶切连接。
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13楼2011-04-02 09:19:25
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by yehuanren at 2011-04-01 18:54:09:
T载体1微升，buffer 5微升，T4 DNA 连接酶 1微升，剩下的都加pcr产物，不加dd水。总共10微升。

支持yehuanren：我们常用的体系是A方案：载体0.5ul，片段3.5ul,剩余的buffer按要求添加，T4ligase 1ul，16度过夜；B:载体0.5ul，片段6ul,剩余的buffer按要求添加，T4ligase 1ul，16度过夜.目的片段浓度要大，以前连过7.3k也是这个体系，每次至少有一个方案出来，菌斑长的少些，楼主可以试一下！
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14楼2011-04-03 09:24:30
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