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xiaojing459

银虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 301998

[交流] 【求助/交流】求助：5.5KPCR片段连接难，请教！！

求助：我的片段约5.5 K, 连接到pGEM-T载体上，老是连接失败，挑不到阳性克隆，麻烦有经验的帮我想想办法，提些建议，多谢！

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1楼 2011-03-31 21:09:08

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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

★
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引用回帖:

Originally posted by yehuanren at 2011-04-01 18:54:09:
T载体1微升，buffer 5微升，T4 DNA 连接酶 1微升，剩下的都加pcr产物，不加dd水。总共10微升。

支持yehuanren：我们常用的体系是A方案：载体0.5ul，片段3.5ul,剩余的buffer按要求添加，T4ligase 1ul，16度过夜；B:载体0.5ul，片段6ul,剩余的buffer按要求添加，T4ligase 1ul，16度过夜.目的片段浓度要大，以前连过7.3k也是这个体系，每次至少有一个方案出来，菌斑长的少些，楼主可以试一下！

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