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xiaojing459

银虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】求助:5.5KPCR片段连接难,请教!!

求助:我的片段约5.5 K, 连接到pGEM-T载体上,老是连接失败,挑不到阳性克隆,麻烦有经验的帮我想想办法,提些建议,多谢!
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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by yehuanren at 2011-04-01 18:54:09:
T载体1微升,buffer 5微升,T4 DNA 连接酶 1微升,剩下的都加pcr产物,不加dd水。总共10微升。

支持yehuanren:我们常用的体系是A方案:载体0.5ul,片段3.5ul,剩余的buffer按要求添加,T4ligase 1ul,16度过夜;B:载体0.5ul,片段6ul,剩余的buffer按要求添加,T4ligase 1ul,16度过夜.目的片段浓度要大,以前连过7.3k也是这个体系,每次至少有一个方案出来,菌斑长的少些,楼主可以试一下!
14楼2011-04-03 09:24:30
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xiaojing459(金币+3):谢谢参与
看看 是不是犯了低级错误
2楼2011-03-31 21:27:57
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soarfalcon8808

铁杆木虫 (职业作家)



xiaojing459(金币+3):谢谢参与
可能操作上有点小问题
3楼2011-03-31 22:05:25
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★ ★ ★
xiaojing459(金币+3):谢谢参与
dhd997(金币+2): good 2011-04-01 08:46:26
当时连过4K+的也没成功,不知道是不是T载承载能力不够的原因。
4楼2011-03-31 22:15:09
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