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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助：5.5KPCR片段连接难，请教！！
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xiaojing459

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助：5.5KPCR片段连接难，请教！！

求助：我的片段约5.5 K, 连接到pGEM-T载体上，老是连接失败，挑不到阳性克隆，麻烦有经验的帮我想想办法，提些建议，多谢！
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1楼 2011-03-31 21:09:08
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by yehuanren at 2011-04-01 18:54:09:
T载体1微升，buffer 5微升，T4 DNA 连接酶 1微升，剩下的都加pcr产物，不加dd水。总共10微升。

支持yehuanren：我们常用的体系是A方案：载体0.5ul，片段3.5ul,剩余的buffer按要求添加，T4ligase 1ul，16度过夜；B:载体0.5ul，片段6ul,剩余的buffer按要求添加，T4ligase 1ul，16度过夜.目的片段浓度要大，以前连过7.3k也是这个体系，每次至少有一个方案出来，菌斑长的少些，楼主可以试一下！
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14楼2011-04-03 09:24:30
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)
★
xiaojing459(金币+3):谢谢参与
看看 是不是犯了低级错误
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2楼2011-03-31 21:27:57
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soarfalcon8808

铁杆木虫 (职业作家)
★
xiaojing459(金币+3):谢谢参与
可能操作上有点小问题
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-03-31 22:05:25
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
xiaojing459(金币+3):谢谢参与
dhd997(金币+2): good 2011-04-01 08:46:26
当时连过4K+的也没成功，不知道是不是T载承载能力不够的原因。
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4楼2011-03-31 22:15:09
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