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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物测序总是不对
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zhangfei7706

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR产物测序总是不对

最近一直在设计豚鼠的HMGCoA R基因，因为NCBI上没有公布序列，就找了其它几个物种的序列，比对后找到相似度高的序列作为保守区设计引物，结果1，无条带；2，有非特异性条带；3，目的条带有但送去测序发现不是该基因。目前一点进展都没有。请问1.保守区怎么确定？2.目的条带一般应多大？3.T载体连接测序的方法。恳请指点
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1楼 2011-01-10 14:51:32
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:34:53
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:49:44
保守区用同源氨基酸序列比对查找。然后根据保守区的氨基酸序列和核酸序列设计兼并引物。



用T载体上的通用引物测序即可。
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2楼2011-01-10 14:55:18
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sfb1020

金虫 (小有名气)
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:35:04
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:49:58
1 保守区就是几个物种都一样的区域，根据保守区设计引物。2 目的条带没有大小要求吧 3 直接送生工测序就行了，我们送的是菌液。
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3楼2011-01-10 14:55:28
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da_da

金虫 (小有名气)
zhangfei7706(金币+2): 2011-01-10 16:58:27
我用过T载体上的通用引物，并回收了PCR产物，得到了目的片段（1300多bp），把它和T载体连接，用BamH1做了单酶切，想看看连接正确与否，又做了琼脂糖凝胶电泳，条带在3000bp左右，根本不对，请教一下问题出在哪啊
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4楼2011-01-10 15:55:35
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amilie030312

金虫 (正式写手)
zhangfei7706(金币+2): 2011-01-10 16:58:39
用软件就可以确定保守序列位置，我比较习惯用BioEdit，找到保守区序列以后再在保守区的范围内看是否能出合适的引物，实在不行就设计个兼并碱基，先用Taq拉，如果拉的出来再用高保真酶拉测序
你测序的序列不对是完全不对还是有部分不对啊，部分不对是可能的，如果都不对那就说明你的引物设计的有问题了，引物设计好了之后先在Blast上面搜一下再做比较靠谱
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5楼2011-01-10 15:59:13
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by da_da at 2011-01-10 15:55:35:
我用过T载体上的通用引物，并回收了PCR产物，得到了目的片段（1300多bp），把它和T载体连接，用BamH1做了单酶切，想看看连接正确与否，又做了琼脂糖凝胶电泳，条带在3000bp左右，根本不对，请教一下问题出在哪啊

你的片段内部是否有BamHi的酶切位点？T载体上呢？
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6楼2011-01-10 15:59:20
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da_da

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-10 15:59:20:



你的片段内部是否有BamHi的酶切位点？T载体上呢？

T载体上有，目的片段上没有，就是想连到T载体上送去测序，拿到目的片段的基因序列。
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7楼2011-01-10 16:18:38
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by da_da at 2011-01-10 16:18:38:

T载体上有，目的片段上没有，就是想连到T载体上送去测序，拿到目的片段的基因序列。

那如果你的载体上只有一个BamHi位点的话，切开应该是将你构建好的质粒开环了，3000bp估计都没有你的载体大。

另外想问下你用的T载体kit是哪家的呢？ promega ？
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8楼2011-01-10 16:22:31
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lxjwishes

银虫 (正式写手)
重先设计引物吧！
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9楼2011-01-11 11:53:50
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haitian0625

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lxjwishes at 2011-01-11 11:53:50:
重先设计引物吧！

我看也是引物特异性不高。
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10楼2011-01-11 16:57:50
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
我不用酶切啊，我根本没设计酶切位点，T载体TA连接就行了，菌液PCR，用目的条带的引物PCR就行，直接把目的条带从载体上扩下来，没用通用引物
关于引物设计，根据我的经验，物种亲缘关系越远越好，根据亲缘关系远的物种保守区设计引物比亲缘关系近的成功率高多了
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11楼2011-01-11 17:58:03
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jackkang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 阳光金鱼唐 at 2011-01-11 17:58:03:
我不用酶切啊，我根本没设计酶切位点，T载体TA连接就行了，菌液PCR，用目的条带的引物PCR就行，直接把目的条带从载体上扩下来，没用通用引物
关于引物设计，根据我的经验，物种亲缘关系越远越好，根据亲缘关系远 ...

我也觉得送经鉴定成功的菌液去测序比较好，自己提取的质粒和PCR产物有可能达不到要求，然后设计兼并引物是最常用的方法，物种亲缘关系越远，如果序列保守的话，那么说明是很保守，设计的引物当然成功率高。
但是，我觉得也可以尝试直接用同一个属物种的EST序列设计特异引物，当然这个EST序列与你想要的那一类基因是有保守区的，可以先用一个基因的CDS序列去研究对象或其亲缘关系近的物种的EST库中Blast，如果有相似性高的EST序列，则可直接用EST序列设计特异引物。
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12楼2011-01-11 18:31:17
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by da_da at 2011-01-10 15:55:35:
我用过T载体上的通用引物，并回收了PCR产物，得到了目的片段（1300多bp），把它和T载体连接，用BamH1做了单酶切，想看看连接正确与否，又做了琼脂糖凝胶电泳，条带在3000bp左右，根本不对，请教一下问题出在哪啊

因为没有连接上，T载体本身就3000bp左右
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13楼2011-01-17 21:12:04
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amilie030312

金虫 (正式写手)
zhangfei7706(金币+2): 2011-01-18 16:45:20
1、用软件来进行序列对比，随便什么软件都可以确定保守序列，当然你输入的近似物种序列越多那么得到的同源序列位置越准确。我个人比较喜欢用BioEdit，其他的DNAMAN、DNAStar等等都可以。
2、目的条带有多大这个问题我没理解诶，是否是我没看明白呢，因为你自己试验的目的条带有多大只有你自己知道啊，不了解你试验的人怎么会知道。找近似物种的序列，看同一个基因在其他近似物种中是多大的就差不多了啊，就算有差别也不会差别太大的。
3、第三个问题可以去看分子克隆，把它当一本圣经来看吧。你90%的问题就都解决了。
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14楼2011-01-18 09:21:27
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