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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物测序总是不对
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zhangfei7706

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR产物测序总是不对

最近一直在设计豚鼠的HMGCoA R基因，因为NCBI上没有公布序列，就找了其它几个物种的序列，比对后找到相似度高的序列作为保守区设计引物，结果1，无条带；2，有非特异性条带；3，目的条带有但送去测序发现不是该基因。目前一点进展都没有。请问1.保守区怎么确定？2.目的条带一般应多大？3.T载体连接测序的方法。恳请指点
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1楼 2011-01-10 14:51:32
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sfb1020

金虫 (小有名气)
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:35:04
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:49:58
1 保守区就是几个物种都一样的区域，根据保守区设计引物。2 目的条带没有大小要求吧 3 直接送生工测序就行了，我们送的是菌液。
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3楼2011-01-10 14:55:28
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:34:53
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:49:44
保守区用同源氨基酸序列比对查找。然后根据保守区的氨基酸序列和核酸序列设计兼并引物。



用T载体上的通用引物测序即可。
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2楼2011-01-10 14:55:18
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da_da

金虫 (小有名气)
zhangfei7706(金币+2): 2011-01-10 16:58:27
我用过T载体上的通用引物，并回收了PCR产物，得到了目的片段（1300多bp），把它和T载体连接，用BamH1做了单酶切，想看看连接正确与否，又做了琼脂糖凝胶电泳，条带在3000bp左右，根本不对，请教一下问题出在哪啊
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4楼2011-01-10 15:55:35
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amilie030312

金虫 (正式写手)
zhangfei7706(金币+2): 2011-01-10 16:58:39
用软件就可以确定保守序列位置，我比较习惯用BioEdit，找到保守区序列以后再在保守区的范围内看是否能出合适的引物，实在不行就设计个兼并碱基，先用Taq拉，如果拉的出来再用高保真酶拉测序
你测序的序列不对是完全不对还是有部分不对啊，部分不对是可能的，如果都不对那就说明你的引物设计的有问题了，引物设计好了之后先在Blast上面搜一下再做比较靠谱
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5楼2011-01-10 15:59:13
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