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zhangfei7706

木虫 (小有名气)

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虫号: 709245

[交流] 【求助/交流】PCR产物测序总是不对

最近一直在设计豚鼠的HMGCoA R基因，因为NCBI上没有公布序列，就找了其它几个物种的序列，比对后找到相似度高的序列作为保守区设计引物，结果1，无条带；2，有非特异性条带；3，目的条带有但送去测序发现不是该基因。目前一点进展都没有。请问1.保守区怎么确定？2.目的条带一般应多大？3.T载体连接测序的方法。恳请指点

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1楼 2011-01-10 14:51:32

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:34:53
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:49:44

保守区用同源氨基酸序列比对查找。然后根据保守区的氨基酸序列和核酸序列设计兼并引物。

用T载体上的通用引物测序即可。

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2楼2011-01-10 14:55:18

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

引用回帖:

Originally posted by da_da at 2011-01-10 15:55:35:
我用过T载体上的通用引物，并回收了PCR产物，得到了目的片段（1300多bp），把它和T载体连接，用BamH1做了单酶切，想看看连接正确与否，又做了琼脂糖凝胶电泳，条带在3000bp左右，根本不对，请教一下问题出在哪啊

你的片段内部是否有BamHi的酶切位点？T载体上呢？

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6楼2011-01-10 15:59:20

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