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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物测序总是不对
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zhangfei7706

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR产物测序总是不对

最近一直在设计豚鼠的HMGCoA R基因，因为NCBI上没有公布序列，就找了其它几个物种的序列，比对后找到相似度高的序列作为保守区设计引物，结果1，无条带；2，有非特异性条带；3，目的条带有但送去测序发现不是该基因。目前一点进展都没有。请问1.保守区怎么确定？2.目的条带一般应多大？3.T载体连接测序的方法。恳请指点
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1楼 2011-01-10 14:51:32
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
我不用酶切啊，我根本没设计酶切位点，T载体TA连接就行了，菌液PCR，用目的条带的引物PCR就行，直接把目的条带从载体上扩下来，没用通用引物
关于引物设计，根据我的经验，物种亲缘关系越远越好，根据亲缘关系远的物种保守区设计引物比亲缘关系近的成功率高多了
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11楼2011-01-11 17:58:03
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:34:53
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:49:44
保守区用同源氨基酸序列比对查找。然后根据保守区的氨基酸序列和核酸序列设计兼并引物。



用T载体上的通用引物测序即可。
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2楼2011-01-10 14:55:18
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sfb1020

金虫 (小有名气)
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:35:04
zhangfei7706(金币+1): 2011-01-10 15:49:58
1 保守区就是几个物种都一样的区域，根据保守区设计引物。2 目的条带没有大小要求吧 3 直接送生工测序就行了，我们送的是菌液。
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3楼2011-01-10 14:55:28
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da_da

金虫 (小有名气)
zhangfei7706(金币+2): 2011-01-10 16:58:27
我用过T载体上的通用引物，并回收了PCR产物，得到了目的片段（1300多bp），把它和T载体连接，用BamH1做了单酶切，想看看连接正确与否，又做了琼脂糖凝胶电泳，条带在3000bp左右，根本不对，请教一下问题出在哪啊
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4楼2011-01-10 15:55:35
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