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zhangfei7706

木虫 (小有名气)

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虫号: 709245

[交流] 【求助/交流】PCR产物测序总是不对

最近一直在设计豚鼠的HMGCoA R基因，因为NCBI上没有公布序列，就找了其它几个物种的序列，比对后找到相似度高的序列作为保守区设计引物，结果1，无条带；2，有非特异性条带；3，目的条带有但送去测序发现不是该基因。目前一点进展都没有。请问1.保守区怎么确定？2.目的条带一般应多大？3.T载体连接测序的方法。恳请指点

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1楼 2011-01-10 14:51:32

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jackkang

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

Originally posted by 阳光金鱼唐 at 2011-01-11 17:58:03:
我不用酶切啊，我根本没设计酶切位点，T载体TA连接就行了，菌液PCR，用目的条带的引物PCR就行，直接把目的条带从载体上扩下来，没用通用引物
关于引物设计，根据我的经验，物种亲缘关系越远越好，根据亲缘关系远 ...

我也觉得送经鉴定成功的菌液去测序比较好，自己提取的质粒和PCR产物有可能达不到要求，然后设计兼并引物是最常用的方法，物种亲缘关系越远，如果序列保守的话，那么说明是很保守，设计的引物当然成功率高。
但是，我觉得也可以尝试直接用同一个属物种的EST序列设计特异引物，当然这个EST序列与你想要的那一类基因是有保守区的，可以先用一个基因的CDS序列去研究对象或其亲缘关系近的物种的EST库中Blast，如果有相似性高的EST序列，则可直接用EST序列设计特异引物。