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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】基因克隆时，酶切有结果，PCR却P不出来
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panl234

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】基因克隆时，酶切有结果，PCR却P不出来 已有6人参与

从九月初开始一直在做基因克隆，目的片段981bp，载体用的是pcDNA3.0（原先师姐已经插入了一个981bp的片段），我把载体重新酶切，连上自己的片段，从cDNA得到的片段是981bp，就是到验证时片段就变成了750bp，特别亮，十分特异！但酶切还是有981bp的带，是哪布出了问题？
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1楼 2010-11-13 13:36:31
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主，你把你的目的序列与载体序列进行一下比对，看其是否有相似序列，如果没有，请核实一下你的引物，如果引物能扩增的片段也是981bp，就再考虑一下你扩增时候延伸时间是否达到一分钟。最后，建议楼主进行测序，无论是扩增还是酶切验证，都是粗略的，最真实的还是测序，建议直接测序。
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2楼2010-11-13 14:42:36
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leo_stu

铁虫 (初入文坛)
★
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拿载体做实验前还是先测序下。
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-------------------------Science，Cell，Nature---------------
3楼2010-11-13 16:22:18
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panl234

银虫 (正式写手)
多谢！
我也很想直接去测序，都做了两遍了！可是老板一看PCR结果就说：不能测！谢谢你的建议
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4楼2010-11-13 16:30:31
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panl234

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by leo_stu at 2010-11-13 16:22:18:
拿载体做实验前还是先测序下。

载体测序？有什么意义？
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5楼2010-11-13 16:31:55
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panl234

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yuhuimeiye at 2010-11-13 14:42:36:
楼主，你把你的目的序列与载体序列进行一下比对，看其是否有相似序列，如果没有，请核实一下你的引物，如果引物能扩增的片段也是981bp，就再考虑一下你扩增时候延伸时间是否达到一分钟。最后，建议楼主进行测序， ...

恩，很有用的建议，谢谢！
我真想直接就去测，可老板一看PCR结果就说测了也不对
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6楼2010-11-13 16:33:24
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)
拿质粒测序
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7楼2010-11-13 16:35:10
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panl234

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yuhuimeiye at 2010-11-13 14:42:36:
楼主，你把你的目的序列与载体序列进行一下比对，看其是否有相似序列，如果没有，请核实一下你的引物，如果引物能扩增的片段也是981bp，就再考虑一下你扩增时候延伸时间是否达到一分钟。最后，建议楼主进行测序， ...

从才cDNA里p用的是pfu酶，延伸时间是1min，验证那步用的是rTaq,1min
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8楼2010-11-13 16:36:00
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★
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PCR可靠性差点，还是酶切比较靠谱，不行就把载体测通看看吧
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9楼2010-11-14 18:19:28
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shuibingyue

新虫 (小有名气)
★
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片段内部没有构载体用的酶切位点吧，既然酶切的时候有981的片段那应该是有目的条带连进去了啊
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10楼2010-11-14 18:42:36
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