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panl234

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】基因克隆时,酶切有结果,PCR却P不出来 已有6人参与

从九月初开始一直在做基因克隆,目的片段981bp,载体用的是pcDNA3.0(原先师姐已经插入了一个981bp的片段),我把载体重新酶切,连上自己的片段,从cDNA得到的片段是981bp,就是到验证时片段就变成了750bp,特别亮,十分特异!但酶切还是有981bp的带,是哪布出了问题?
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
楼主,你把你的目的序列与载体序列进行一下比对,看其是否有相似序列,如果没有,请核实一下你的引物,如果引物能扩增的片段也是981bp,就再考虑一下你扩增时候延伸时间是否达到一分钟。最后,建议楼主进行测序,无论是扩增还是酶切验证,都是粗略的,最真实的还是测序,建议直接测序。
2楼2010-11-13 14:42:36
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leo_stu

铁虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
拿载体做实验前还是先测序下。
-------------------------Science,Cell,Nature---------------
3楼2010-11-13 16:22:18
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panl234

银虫 (正式写手)

多谢!
我也很想直接去测序,都做了两遍了!可是老板一看PCR结果就说:不能测!谢谢你的建议
4楼2010-11-13 16:30:31
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panl234

银虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by leo_stu at 2010-11-13 16:22:18:
拿载体做实验前还是先测序下。

载体测序?有什么意义?
5楼2010-11-13 16:31:55
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panl234

银虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by yuhuimeiye at 2010-11-13 14:42:36:
楼主,你把你的目的序列与载体序列进行一下比对,看其是否有相似序列,如果没有,请核实一下你的引物,如果引物能扩增的片段也是981bp,就再考虑一下你扩增时候延伸时间是否达到一分钟。最后,建议楼主进行测序, ...

恩,很有用的建议,谢谢!
我真想直接就去测,可老板一看PCR结果就说测了也不对
6楼2010-11-13 16:33:24
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)

拿质粒测序
7楼2010-11-13 16:35:10
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panl234

银虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by yuhuimeiye at 2010-11-13 14:42:36:
楼主,你把你的目的序列与载体序列进行一下比对,看其是否有相似序列,如果没有,请核实一下你的引物,如果引物能扩增的片段也是981bp,就再考虑一下你扩增时候延伸时间是否达到一分钟。最后,建议楼主进行测序, ...

从才cDNA里p用的是pfu酶,延伸时间是1min,验证那步用的是rTaq,1min
8楼2010-11-13 16:36:00
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
PCR可靠性差点,还是酶切比较靠谱,不行就把载体测通看看吧
9楼2010-11-14 18:19:28
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shuibingyue

新虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
片段内部没有构载体用的酶切位点吧,既然酶切的时候有981的片段那应该是有目的条带连进去了啊
10楼2010-11-14 18:42:36
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