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angel_yy

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】求构建质粒的具体步骤谢谢已有4人参与

刚进入分子生物学实验室对质粒的构建很困惑，求构建质粒的具体步骤谢谢

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1楼 2010-10-12 16:52:39

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feiye2214

木虫 (正式写手)

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):热心虫友，谢谢交流。 2010-10-12 21:54:36

引用回帖:

Originally posted by angel_yy at 2010-10-12 18:48:08:

谢谢啦这些我知道但是对这几个步骤的先后顺序我搞不大明白如果学长有时间的话可不可以说的详细一点非常感谢

那哥哥就拿自己怎么重组一个质粒来说说！
构建质粒大体有两种形式，一是加启动子，二是加基因序列
我之前做的是给一个空质粒（无启动子）加上一个自己做的启动子，启动子序列是来自青鱼的b-actin基因的调控序列，这个序列已经被提交到NCBI上的，所以找到引物（肯定有文章，因为已经提交了），要不设计一个引物（因为有序列了，很好设计，有软件，或者找公司设计），从引物到PCR就不用说了吧，把这段序列抠出来！（再插一句，把酶切位点设计进引物的两端，后面详细）
既然是空质粒，那么在基因（一般是标记基因GFP/EGFP，用来检测启动子效果）的前面肯定有酶切位点，就是前面说到的酶切位点，顺序不能搞反
这样，把PCR出来的片段（两段已经有酶切位点序列了）和空载质粒同时用相应的内切酶酶切，那么都具有粘性末端了，在把具有粘性末端的质粒（线性的了，被切开了）和PCR片段混合加酶链接，组装成你需要的质粒！！OK
效率很低的，得到的重组质粒当然很少，再把得到的重组质粒转化进大肠杆菌感受态细胞中，使其大量的复制（扩大培养），然后你提取菌液里的质粒，检测，留种！OK啦
再不清晰的，M我吧