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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求构建质粒的具体步骤 谢谢
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angel_yy

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】求构建质粒的具体步骤 谢谢 已有4人参与

刚进入分子生物学实验室对质粒的构建很困惑，求构建质粒的具体步骤 谢谢
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1楼 2010-10-12 16:52:39
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D-frank

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
抱着学习的态度抢沙发，围观下楼
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有微博的好友加我哦，搜D-frank就行
2楼2010-10-12 17:37:04
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feiye2214

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
PCR,酶切，连接，转化感受态，提质粒，鉴定，扩大培养，留种，OK
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3楼2010-10-12 17:42:13
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woaiwyj

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
网上有很多这方面帖子的 自己搜搜 很多的
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4楼2010-10-12 17:59:06
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angel_yy

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-10-12 17:42:13:
PCR,酶切，连接，转化感受态，提质粒，鉴定，扩大培养，留种，OK

谢谢啦 这些我知道但是对这几个步骤的先后顺序我搞不大明白 如果学长有时间的话可不可以说的详细一点   非常感谢
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5楼2010-10-12 18:48:08
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angel_yy

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by woaiwyj at 2010-10-12 17:59:06:
网上有很多这方面帖子的 自己搜搜 很多的

谢谢 我是外专业的 没有学过生物 所以 有些东西我有点搞不明白 所以就发帖求助了
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6楼2010-10-12 18:49:40
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feiye2214

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):热心虫友，谢谢交流。 2010-10-12 21:54:36
引用回帖:
Originally posted by angel_yy at 2010-10-12 18:48:08:


谢谢啦 这些我知道但是对这几个步骤的先后顺序我搞不大明白 如果学长有时间的话可不可以说的详细一点   非常感谢

那哥哥就拿自己怎么重组一个质粒来说说！
构建质粒大体有两种形式，一是加启动子，二是加基因序列
我之前做的是给一个空质粒（无启动子）加上一个自己做的启动子，启动子序列是来自青鱼的b-actin基因的调控序列，这个序列已经被提交到NCBI上的，所以找到引物（肯定有文章，因为已经提交了），要不设计一个引物（因为有序列了，很好设计，有软件，或者找公司设计），从引物到PCR就不用说了吧，把这段序列抠出来！（再插一句，把酶切位点设计进引物的两端，后面详细）
既然是空质粒，那么在基因（一般是标记基因GFP/EGFP，用来检测启动子效果）的前面肯定有酶切位点，就是前面说到的酶切位点，顺序不能搞反
这样，把PCR出来的片段（两段已经有酶切位点序列了）和空载质粒同时用相应的内切酶酶切，那么都具有粘性末端了，在把具有粘性末端的质粒（线性的了，被切开了）和PCR片段混合加酶链接，组装成你需要的质粒！！OK
效率很低的，得到的重组质粒当然很少，再把得到的重组质粒转化进大肠杆菌感受态细胞中，使其大量的复制（扩大培养），然后你提取菌液里的质粒，检测，留种！OK啦
再不清晰的，M我吧
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7楼2010-10-12 21:44:20
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angel_yy

金虫 (正式写手)
[quote]Originally posted by feiye2214 at 2010-10-12 21:44:20:

那哥哥就拿自己怎么重组一个质粒来说说！
构建质粒大体有两种形式，一是加启动子，二是加基因序列
我之前做的是给一个空质粒（无启动子）加上一个自己做的启动子，启动子序列是来自青鱼的b-actin基因的调控序 ... [/qu


谢谢学长 嘿嘿
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8楼2010-10-13 23:17:48
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