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angel_yy金虫 (正式写手)
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【求助/交流】求构建质粒的具体步骤 谢谢 已有4人参与
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| 刚进入分子生物学实验室对质粒的构建很困惑，求构建质粒的具体步骤 谢谢 |
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2楼2010-10-12 17:37:04
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angel_yy
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feiye2214
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):热心虫友，谢谢交流。 2010-10-12 21:54:36
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那哥哥就拿自己怎么重组一个质粒来说说！ 构建质粒大体有两种形式，一是加启动子，二是加基因序列 我之前做的是给一个空质粒（无启动子）加上一个自己做的启动子，启动子序列是来自青鱼的b-actin基因的调控序列，这个序列已经被提交到NCBI上的，所以找到引物（肯定有文章，因为已经提交了），要不设计一个引物（因为有序列了，很好设计，有软件，或者找公司设计），从引物到PCR就不用说了吧，把这段序列抠出来！（再插一句，把酶切位点设计进引物的两端，后面详细） 既然是空质粒，那么在基因（一般是标记基因GFP/EGFP，用来检测启动子效果）的前面肯定有酶切位点，就是前面说到的酶切位点，顺序不能搞反 这样，把PCR出来的片段（两段已经有酶切位点序列了）和空载质粒同时用相应的内切酶酶切，那么都具有粘性末端了，在把具有粘性末端的质粒（线性的了，被切开了）和PCR片段混合加酶链接，组装成你需要的质粒！！OK 效率很低的，得到的重组质粒当然很少，再把得到的重组质粒转化进大肠杆菌感受态细胞中，使其大量的复制（扩大培养），然后你提取菌液里的质粒，检测，留种！OK啦 再不清晰的，M我吧 |
7楼2010-10-12 21:44:20
angel_yy
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8楼2010-10-13 23:17:48
