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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接表达载体
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虫虫6527

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接表达载体 已有10人参与

我的目的片段连接表达载体，目的片段两端加了保护碱基，直接用PCR产物回收做双酶切，连接，可是一直连不上。有人建议我连到T载体上再切下来，再做连接。这样做效果好吗？还是有什么别的办法？请各位指教。
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1楼 2010-07-22 08:51:04
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-22 12:35:25
用T载体效果会好点，至少你知道你两端已经都被切开。
直接双酶切你并不知道酶切效果，而且和你的保护碱基设计有关
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2楼2010-07-22 09:59:19
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-22 12:35:34
PCR产物直接回收做酶切与T载体酶切相比效果要差，建议lz还是用T载体比较保险。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
3楼2010-07-22 10:29:02
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louli

铜虫 (小有名气)
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-22 12:35:41
换一下酶切位点吧 我就没连T载体上，饿哦是直接切得，效果也挺好的。
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4楼2010-07-22 10:34:51
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
★
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可以不连T载体的，麻烦！我没连过！
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5楼2010-07-22 11:26:09
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-22 12:35:48
楼主的问题很可能有几个原因，一个是你的加保护碱基数不够，二是引物有可能合成错了。还有一个双酶切效率低。另外回收后的量要保证。连接体系比率也要正确
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6楼2010-07-22 11:48:39
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
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这个和酶切位点有关系 好切的酶可以不连T
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7楼2010-07-22 14:18:47
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louli

铜虫 (小有名气)
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你的两个酶Buffer都是共同的吗？
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8楼2010-07-23 20:16:41
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周_yan

木虫 (小有名气)
可能与你的保护碱基有关，也可能酶切位点有关，有的酶容易发生碱基化而导致切不开。
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9楼2010-07-26 11:26:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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说说是哪两个酶？厂家？以及保护碱基怎么设计的
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10楼2010-07-26 11:46:57
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