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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接效率问题
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ymzfeng

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接效率问题 已有3人参与

构建基因表达载体时，设计扩增基因片段的引物5‘端引入了相应的酶切位点及保护碱基，将PCR产物回收纯化后，与目的载体T4连接，老连接不上，想请问用加了保护碱基的PCR产物直接做连接是不是不太好？是不是要做个TA克隆，从T载体上酶切纯化后再与目的载体连接？
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1楼 2010-09-03 15:27:42
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周_yan

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2):谢谢交流 2010-09-03 19:23:58
我也用同样的方法设计引物，一般都是PCR产物回收后先连接克隆载体即T载体，然后提T载体的质粒酶切，再于表达载体连接，成功的效率很高。
PCR产物回收纯化后一般还需要去磷酸化，再于表达载体连接。不知你有没有去磷酸化？
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2楼2010-09-03 16:26:00
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塞外雨

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也是一直连接转化不出来
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
3楼2010-09-03 16:27:56
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 周_yan at 2010-09-03 16:26:00:
我也用同样的方法设计引物，一般都是PCR产物回收后先连接克隆载体即T载体，然后提T载体的质粒酶切，再于表达载体连接，成功的效率很高。
PCR产物回收纯化后一般还需要去磷酸化，再于表达载体连接。不知你有没有去 ...

谢谢，之前没去磷酸化
现在已经做了TA 克隆，再去连接了
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4楼2010-09-04 14:45:43
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