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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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虫虫6527

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接表达载体 已有10人参与

我的目的片段连接表达载体,目的片段两端加了保护碱基,直接用PCR产物回收做双酶切,连接,可是一直连不上。有人建议我连到T载体上再切下来,再做连接。这样做效果好吗?还是有什么别的办法?请各位指教。
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-22 12:35:25
用T载体效果会好点,至少你知道你两端已经都被切开。
直接双酶切你并不知道酶切效果,而且和你的保护碱基设计有关
2楼2010-07-22 09:59:19
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-22 12:35:34
PCR产物直接回收做酶切与T载体酶切相比效果要差,建议lz还是用T载体比较保险。
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
3楼2010-07-22 10:29:02
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louli

铜虫 (小有名气)

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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-22 12:35:41
换一下酶切位点吧 我就没连T载体上,饿哦是直接切得,效果也挺好的。
4楼2010-07-22 10:34:51
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小周

铁杆木虫 (著名写手)


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可以不连T载体的,麻烦!我没连过!
5楼2010-07-22 11:26:09
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sunyongle1

木虫 (正式写手)

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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-22 12:35:48
楼主的问题很可能有几个原因,一个是你的加保护碱基数不够,二是引物有可能合成错了。还有一个双酶切效率低。另外回收后的量要保证。连接体系比率也要正确
6楼2010-07-22 11:48:39
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)


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这个和酶切位点有关系 好切的酶可以不连T
7楼2010-07-22 14:18:47
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louli

铜虫 (小有名气)


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你的两个酶Buffer都是共同的吗?
8楼2010-07-23 20:16:41
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周_yan

木虫 (小有名气)

可能与你的保护碱基有关,也可能酶切位点有关,有的酶容易发生碱基化而导致切不开。
9楼2010-07-26 11:26:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
说说是哪两个酶?厂家?以及保护碱基怎么设计的
10楼2010-07-26 11:46:57
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