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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原核表达
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辉辉集团

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】原核表达 已有7人参与

我在做原核表达时，加了组氨酸标签，然后用镍柱纯化，纯化出来的蛋白跑电泳条带很好，纯度很高，但是用PBS透析掉咪唑，再用聚乙二醇浓缩后，然后再去跑电泳，条带变杂了很多，我怀疑是蛋白降解了，请问各位高手 怎么办  谢谢！
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1楼 2010-07-20 08:28:18
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张力民1598

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-20 08:32:51
会不会是你浓缩之后的蛋白浓度变浓了，导致之前看不到的蛋白可以看到了
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2楼2010-07-20 08:31:36
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
加入蛋白酶抑制剂
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好好学习，天天向上
3楼2010-07-20 08:37:58
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辉辉集团

银虫 (正式写手)

嗯 我也考虑过这个原因

引用回帖:
Originally posted by 张力民1598 at 2010-07-20 08:31:36:
会不会是你浓缩之后的蛋白浓度变浓了，导致之前看不到的蛋白可以看到了

嗯 我也考虑过这个原因   我上样量减少 也就基本上是同等粗细的条带了 还是很明显有杂条带
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4楼2010-07-20 08:40:32
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辉辉集团

银虫 (正式写手)

谢谢你的建议

引用回帖:
Originally posted by 寂寞之巅 at 2010-07-20 08:37:58:
加入蛋白酶抑制剂

我曾尝试过VC 和EDTA  都没有起到什么作用 请问还有什么其他的东西可以尝试吗  谢谢
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5楼2010-07-20 08:41:31
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寂寞之巅

铁虫 (小有名气)
★ ★
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看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-20 12:01:21
引用回帖:
Originally posted by 辉辉集团 at 2010-07-20 08:41:31:

我曾尝试过VC 和EDTA  都没有起到什么作用 请问还有什么其他的东西可以尝试吗  谢谢

你可以看一下文献 文献中浓缩时加了几种  
有没有考虑超滤浓缩   
你的蛋白有很多条带 是大于还是小于  你还写考虑浓缩时蛋白浓度多高蛋白聚集的情况
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好好学习，天天向上
6楼2010-07-20 10:24:41
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
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看天(金币+1):谢谢回答 2010-07-20 12:01:51
1 在SDS-PAGE图中，高盐度的样品中微量蛋白不容易看见
2 无论你怎么纯化，都不可能是100%的纯的，IMAC能到95%一般就是不错的。
3 确认你的试剂，例如PBS中有无蛋白污染。
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7楼2010-07-20 10:34:55
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
浓缩后见杂带很正常的一种现象。
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8楼2010-07-20 11:58:59
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以加PMSF吧
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9楼2010-07-20 12:15:50
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shenlin0514

木虫 (正式写手)

无名小虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这种问题一般是浓度加大后杂蛋白也随之出现，建议再次上样镍柱
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Never say never
10楼2010-07-20 15:04:34
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