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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原核表达
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银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】原核表达 已有7人参与

我在做原核表达时，加了组氨酸标签，然后用镍柱纯化，纯化出来的蛋白跑电泳条带很好，纯度很高，但是用PBS透析掉咪唑，再用聚乙二醇浓缩后，然后再去跑电泳，条带变杂了很多，我怀疑是蛋白降解了，请问各位高手 怎么办  谢谢！
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1楼 2010-07-20 08:28:18
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银虫 (正式写手)

嗯 我也考虑过这个原因

引用回帖:
Originally posted by 张力民1598 at 2010-07-20 08:31:36:
会不会是你浓缩之后的蛋白浓度变浓了，导致之前看不到的蛋白可以看到了

嗯 我也考虑过这个原因   我上样量减少 也就基本上是同等粗细的条带了 还是很明显有杂条带
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4楼2010-07-20 08:40:32
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银虫 (正式写手)

谢谢你的建议

引用回帖:
Originally posted by 寂寞之巅 at 2010-07-20 08:37:58:
加入蛋白酶抑制剂

我曾尝试过VC 和EDTA  都没有起到什么作用 请问还有什么其他的东西可以尝试吗  谢谢
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5楼2010-07-20 08:41:31
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银虫 (正式写手)

超滤

引用回帖:
Originally posted by 寂寞之巅 at 2010-07-20 10:24:41:

你可以看一下文献 文献中浓缩时加了几种  
有没有考虑超滤浓缩   
你的蛋白有很多条带 是大于还是小于  你还写考虑浓缩时蛋白浓度多高蛋白聚集的情况

超滤 暂时还没有做过
条带都是小于目的蛋白的
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12楼2010-07-21 11:03:28
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银虫 (正式写手)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by lwiaanngg at 2010-07-20 10:34:55:
1 在SDS-PAGE图中，高盐度的样品中微量蛋白不容易看见
2 无论你怎么纯化，都不可能是100%的纯的，IMAC能到95%一般就是不错的。
3 确认你的试剂，例如PBS中有无蛋白污染。

PBA中肯定是没有杂蛋白的
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13楼2010-07-21 11:05:32
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银虫 (正式写手)

我要的是纯度啊 呵呵

引用回帖:
Originally posted by lwiaanngg at 2010-07-21 21:32:57:


你跑胶后用银染试试，因为你并不知道配PBS的试剂中有没有痕量蛋白的存在啊
如果你试过了PBS，你算一下你的蛋白的purity，〉90%一般就可以接受的。
是否能跑出好的SDS-PAGE不光取决于你的蛋白的纯度，还有跑 ...

啊 胶好不好看不重要 我要的是纯度啊 呵呵
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15楼2010-07-22 11:39:35
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