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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于大肠杆菌中蛋白表达的问题
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泡泡9706

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于大肠杆菌中蛋白表达的问题已有8人参与

在大肠杆菌中表达了一个酶蛋白，该酶在原菌中是胞外酶，在载体上插入的是酶基因包括信号肽在内的全部序列，请问一下，有可能会在胞内或者周质空间产生切去信号肽的该酶吗？
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1楼2010-06-13 14:06:37
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biogefart

木虫 (著名写手)
★
泡泡9706(金币+1):谢谢！那外源的信号肽大肠杆菌也有可能识别吗？ 2010-06-13 14:36:54
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-06-13 15:59:05
胞内不太可能吧，应该在周质里面
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闹太套
2楼2010-06-13 14:16:45
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
1949stone:把包涵体洗出来不就好了 大量表达 后来的复性也学有难度 如果是有活性的 乐开花了 2010-06-13 16:00:53
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 16:59:41
看运气，不形成包涵体你就万幸吧
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3楼2010-06-13 15:29:46
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liyong1981

金虫 (正式写手)
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 16:59:37
这个，真不好说，做了才知道，因为原核生物表达出的蛋白比真核的复杂，你都不知道它到底怎么折叠的，那3级结构，千奇百怪~
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4楼2010-06-13 16:46:59
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gene001

金虫 (正式写手)

就是个普通教师
★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:54:04
原菌的信号肽是否被大肠杆菌所识别和你的酶蛋白在大肠杆菌中可溶（正确折叠）是关键，没有文献支持的话只有自己试了才知道结果！哈哈
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大家共同交流、共同提高！！！
5楼2010-06-15 00:57:30
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lifeip

至尊木虫 (知名作家)
★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:54:14
应该是胞内表达，而且一般的酶都比较大，表达产物形成包涵体的可能性很大。
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6楼2010-06-15 01:10:03
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:00:02
不知道楼主加入外源基因信号肽的目的是什么，一般表达用载体自身的信号肽不是可以吗？外源信号肽如果大肠杆菌不能识别蛋白会形成包涵体的。
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7楼2010-06-15 08:13:23
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月月大可

木虫 (著名写手)
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:03:02
建议切除信号肽胞内表达，如果大肠杆菌无法切除你的信号肽，那么信号肽的存在很有可能影响酶的活性。
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8楼2010-06-15 08:36:07
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zemin_fang at 2010-06-15 08:13:23:
不知道楼主加入外源基因信号肽的目的是什么，一般表达用载体自身的信号肽不是可以吗？外源信号肽如果大肠杆菌不能识别蛋白会形成包涵体的。

引物是我上届师兄设计的，当时我刚接触，就接着做了。他把载体自带的信号肽切掉了，插入的是带有信号肽的全序列。现在表达出来了，产生包涵体，但我优化条件后也能产一部分可溶蛋白了。我想问这部分蛋白有没有可能切掉信号肽进入周质空间呢？
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9楼2010-06-17 17:02:45
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-06-17 21:24:17
引用回帖:
Originally posted by 泡泡9706 at 2010-06-17 17:02:45:

引物是我上届师兄设计的，当时我刚接触，就接着做了。他把载体自带的信号肽切掉了，插入的是带有信号肽的全序列。现在表达出来了，产生包涵体，但我优化条件后也能产一部分可溶蛋白了。我想问这部分蛋白有没有可 ...

带上基因自身的信号肽形成包涵体的几率非常大，而且大肠杆菌不一定能识别，蛋白进入周知空间也就不可能了。
如果要验证，可以用溶菌酶破解细胞壁然后收集上清SDS-PAGE电泳检测或测定酶活力。
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10楼2010-06-17 20:12:29
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