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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒与目的片段连接
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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幕竹清风

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒与目的片段连接 已有1人参与

各位师兄师姐同学们，我最近在构建敲除质粒，奇怪的是对照的菌比其他的板子长得都多，做了三次，都是这样的，而且菌落PCR没有目的片段，测序也全部不行，按理说，目的片段是合成的呀，怎么会连不进去呢？还长得比对照少？大家有没有遇到类似的情况呢？

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1楼 2017-05-20 00:06:29
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莫落

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-24 07:45:42
给的信息太少了；载体酶切尽量充分保证酶切完全，跑胶回收，最好做个去磷酸化；连接时注意vector和insert的比例；最好设置负对照，不加insert（等量的灭菌水）。

话说构建的时细菌的敲除质粒吗？用的什么质粒啊？
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2楼2017-05-23 14:15:47
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幕竹清风

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 莫落 at 2017-05-23 14:15:47
给的信息太少了；载体酶切尽量充分保证酶切完全，跑胶回收，最好做个去磷酸化；连接时注意vector和insert的比例；最好设置负对照，不加insert（等量的灭菌水）。

话说构建的时细菌的敲除质粒吗？用的什么质粒啊？

目的片段合成的，是没有磷酸基团的，所以不能去磷酸化

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3楼2017-05-23 22:29:28
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幕竹清风

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 莫落 at 2017-05-23 14:15:47
给的信息太少了；载体酶切尽量充分保证酶切完全，跑胶回收，最好做个去磷酸化；连接时注意vector和insert的比例；最好设置负对照，不加insert（等量的灭菌水）。

话说构建的时细菌的敲除质粒吗？用的什么质粒啊？

我想做慢病毒质粒，用的pSIREN....英文名称具体记不大清楚了，是一种转录绿色荧光质粒

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4楼2017-05-23 22:33:01
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莫落

木虫 (正式写手)
可能是载体自连了

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5楼2017-05-23 23:05:26
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莫落

木虫 (正式写手)
合成的片段也要酶切一下在连接的

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6楼2017-05-23 23:05:56
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幕竹清风

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 莫落 at 2017-05-23 23:05:56
合成的片段也要酶切一下在连接的

公司合成的片段在设计的时候就考虑到了酶切位点，所以合成的应该是酶切后的末端

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7楼2017-05-24 00:51:06
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莫落

木虫 (正式写手)
我们合成的片段都是放在载体上的，你先跟公司了解一下吧

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8楼2017-05-24 07:49:14
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hemary

新虫 (初入文坛)
请问你的问题解决了吗

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9楼2018-03-12 21:52:14
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