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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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幕竹清风

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒与目的片段连接 已有1人参与

各位师兄师姐同学们,我最近在构建敲除质粒,奇怪的是对照的菌比其他的板子长得都多,做了三次,都是这样的,而且菌落PCR没有目的片段,测序也全部不行,按理说,目的片段是合成的呀,怎么会连不进去呢?还长得比对照少?大家有没有遇到类似的情况呢?

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莫落

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-24 07:45:42
给的信息太少了;载体酶切尽量充分保证酶切完全,跑胶回收,最好做个去磷酸化;连接时注意vector和insert的比例;最好设置负对照,不加insert(等量的灭菌水)。

话说构建的时细菌的敲除质粒吗?用的什么质粒啊?
2楼2017-05-23 14:15:47
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幕竹清风

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 莫落 at 2017-05-23 14:15:47
给的信息太少了;载体酶切尽量充分保证酶切完全,跑胶回收,最好做个去磷酸化;连接时注意vector和insert的比例;最好设置负对照,不加insert(等量的灭菌水)。

话说构建的时细菌的敲除质粒吗?用的什么质粒啊?

目的片段合成的,是没有磷酸基团的,所以不能去磷酸化

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3楼2017-05-23 22:29:28
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幕竹清风

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 莫落 at 2017-05-23 14:15:47
给的信息太少了;载体酶切尽量充分保证酶切完全,跑胶回收,最好做个去磷酸化;连接时注意vector和insert的比例;最好设置负对照,不加insert(等量的灭菌水)。

话说构建的时细菌的敲除质粒吗?用的什么质粒啊?

我想做慢病毒质粒,用的pSIREN....英文名称具体记不大清楚了,是一种转录绿色荧光质粒

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4楼2017-05-23 22:33:01
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莫落

木虫 (正式写手)

5楼2017-05-23 23:05:26
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莫落

木虫 (正式写手)

合成的片段也要酶切一下在连接的

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6楼2017-05-23 23:05:56
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幕竹清风

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 莫落 at 2017-05-23 23:05:56
合成的片段也要酶切一下在连接的

公司合成的片段在设计的时候就考虑到了酶切位点,所以合成的应该是酶切后的末端

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7楼2017-05-24 00:51:06
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莫落

木虫 (正式写手)

我们合成的片段都是放在载体上的,你先跟公司了解一下吧

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8楼2017-05-24 07:49:14
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hemary

新虫 (初入文坛)

9楼2018-03-12 21:52:14
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