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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Not1 单切后目的片段连接不上
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meiting

木虫 (正式写手)

新手上路

[求助] Not1 单切后目的片段连接不上 已有2人参与

载体分别是5.4Kb和10Kb，目的片段大小约为4.5kb，分别用Not1 单切质粒，目的载体进行去磷酸化，切胶回收后得到目的载体和目的片段，用NEB的连接酶16度过夜连接，目的载体与目的片段的摩尔比例是1：3，然后转化、鉴定，一个阳性都没有，各位大神有没有什么好招没？
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目前的我们谁也改变不了，能做的只是充实自己，改变自己……
1楼 2016-02-15 09:18:20
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段太大了，增加摩尔数的比例吧，增加到1:5-1:10。
检测没有阳性是什么意思？有单克隆但没有目的片段还是没有单克隆？如果后者，那么是好事，说明载体酶切完全并且去磷酸化完全。如果前者的话还是增加比例吧，毕竟片段和载体都太大，相互碰撞几率较低。
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2楼2016-02-15 10:49:20
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diaomou

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是没长菌落吗？
10kb的载体太大了，化学感受态细胞能接受的连接产物上限好像就是10kb。
外国的T4连接酶不需要过夜连接，25度1小时就够了,连接时间太长可能多个片段连起来，形成大产物，无法转化。
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3楼2016-02-20 15:33:54
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diaomou

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-15 10:49:20
片段太大了，增加摩尔数的比例吧，增加到1:5-1:10。
检测没有阳性是什么意思？有单克隆但没有目的片段还是没有单克隆？如果后者，那么是好事，说明载体酶切完全并且去磷酸化完全。如果前者的话还是增加比例吧，毕竟 ...

碰撞几率低不低跟片段大小没关系吧？提高浓度自然几率就大了
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4楼2016-02-20 15:34:53
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