应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Not1 单切后目的片段连接不上
41/1返回列表
查看: 1158  |  回复: 3
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

meiting

木虫 (正式写手)

新手上路

[求助] Not1 单切后目的片段连接不上 已有2人参与

载体分别是5.4Kb和10Kb，目的片段大小约为4.5kb，分别用Not1 单切质粒，目的载体进行去磷酸化，切胶回收后得到目的载体和目的片段，用NEB的连接酶16度过夜连接，目的载体与目的片段的摩尔比例是1：3，然后转化、鉴定，一个阳性都没有，各位大神有没有什么好招没？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
目前的我们谁也改变不了，能做的只是充实自己，改变自己……
1楼 2016-02-15 09:18:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段太大了，增加摩尔数的比例吧，增加到1:5-1:10。
检测没有阳性是什么意思？有单克隆但没有目的片段还是没有单克隆？如果后者，那么是好事，说明载体酶切完全并且去磷酸化完全。如果前者的话还是增加比例吧，毕竟片段和载体都太大，相互碰撞几率较低。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2016-02-15 10:49:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

diaomou

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是没长菌落吗？
10kb的载体太大了，化学感受态细胞能接受的连接产物上限好像就是10kb。
外国的T4连接酶不需要过夜连接，25度1小时就够了,连接时间太长可能多个片段连起来，形成大产物，无法转化。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2016-02-20 15:33:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

diaomou

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-15 10:49:20
片段太大了，增加摩尔数的比例吧，增加到1:5-1:10。
检测没有阳性是什么意思？有单克隆但没有目的片段还是没有单克隆？如果后者，那么是好事，说明载体酶切完全并且去磷酸化完全。如果前者的话还是增加比例吧，毕竟 ...

碰撞几率低不低跟片段大小没关系吧？提高浓度自然几率就大了
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2016-02-20 15:34:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 meiting 的主题更新
41/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 5/250 2026-11-01 19:50 by xzcv0Tehd8lQ
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 13/650 2026-11-01 16:48 by BCdvBAEpt3zm
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 18/900 2026-11-01 16:48 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 22/1100 2026-11-01 16:35 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 22/1100 2026-11-01 16:35 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 14/700 2026-11-01 16:32 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 9/450 2026-11-01 14:55 by BCdvBAEpt3zm
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 10/500 2026-11-01 14:50 by BCdvBAEpt3zm
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 7/350 2026-11-01 14:50 by BCdvBAEpt3zm
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 14/700 2026-11-01 14:24 by BCdvBAEpt3zm
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 3/150 2026-11-01 12:53 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 6/300 2026-11-01 12:53 by BCdvBAEpt3zm
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 5/250 2026-11-01 12:51 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 6/300 2026-11-01 12:40 by BCdvBAEpt3zm
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 8/400 2026-11-01 12:38 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 10/500 2026-11-01 12:27 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 17/850 2026-11-01 12:24 by BCdvBAEpt3zm
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 16/800 2026-11-01 12:14 by BCdvBAEpt3zm
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 15/750 2026-11-01 12:11 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 9/450 2026-11-01 10:53 by BCdvBAEpt3zm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭