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雪糕哦

新虫 (著名写手)

[求助] TAKARA T4 DNA Ligase使用已有1人参与

TAKARA T4 DNA Ligase使用问题:PET28a和基因连接,T4 DNA Ligase和Buffer用量多少呢?
   10微升体系:载体1,基因6,连接酶1,buffer1,水1和载体1,基因6,连接酶0.5,buffer1,水1.5。两都试过了,连不上。
   求大神解答。

TAKARA T4 DNA Ligase使用


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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

连接时比较关键的是载体和目的片段的比例  连接酶的话0.5微升就可以
所以我觉得连不上应该不是连接酶的问题

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2017-03-17 15:41:16
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雪糕哦

新虫 (著名写手)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 十四_14 at 2017-03-17 15:41:16
连接时比较关键的是载体和目的片段的比例  连接酶的话0.5微升就可以
所以我觉得连不上应该不是连接酶的问题

感谢回答。之前做得载体和基因比例都是1:6,今天再做一次1:3的,看看能不能连上。

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3楼2017-03-17 15:50:48
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jcstone1027

铁杆木虫 (正式写手)

木虫

我们最近也在做连接,我们的体系是25微升,我觉得载体根据浓度还是尽量少加点,我们也一直连接效率非常低,阳性克隆非常少,你需要验证下是不是连接酶是不是有问题。

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学习,交流
4楼2017-03-17 22:39:21
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Liumengya

木虫 (正式写手)

你怎么确定没连上,筛选是个很重要的步骤

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5楼2017-03-17 23:43:19
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都从新来过

新虫 (初入文坛)

28a是低拷贝 首先说下体系载体1.5  基因6  10??buffer 1  水0.5 酶0.5       16度水浴4到6hr

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6楼2017-03-18 00:09:03
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都从新来过

新虫 (初入文坛)

水1  我们的比例一般在1比3和1比6之间    当然不排除有的基因确实不好连

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

7楼2017-03-18 00:11:09
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huxi_8

至尊木虫 (著名写手)

5311  片段质粒buffer酶,每次都成!

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huxi
8楼2017-03-18 01:47:48
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雪糕哦

新虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Liumengya at 2017-03-17 23:43:19
你怎么确定没连上,筛选是个很重要的步骤

转化完了蓝白斑筛选没长菌。

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9楼2017-03-18 20:17:15
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雪糕哦

新虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by jcstone1027 at 2017-03-17 22:39:21
我们最近也在做连接,我们的体系是25微升,我觉得载体根据浓度还是尽量少加点,我们也一直连接效率非常低,阳性克隆非常少,你需要验证下是不是连接酶是不是有问题。

连接酶是新的,我刚打开的。载体也是酶切完了,已经切开的和未切开的跑了张图,确定了载体也切开了的。

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10楼2017-03-18 20:18:19
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