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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » qPCR扩增效率问题
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mochenmi

铜虫 (小有名气)

[求助] qPCR扩增效率问题 已有1人参与

之前查阅资料了解到要使用2-（deta,deta）Ct值分析方法，必须使目的基因与内参基因扩增效率一致。
因此采用cDNA梯度稀释法绘制标准曲线计算扩增效率。我有10个目的基因和1个内参，得到的结果从130%到190%不等，R方均大于0.99。
想问一下：1. 扩增效率这么高怎么办？
2. 另外扩增效率不一致的话，是不是只能用双标准曲线分析方法了？可是我有10个目的基因，只能一个一个弄嘛？急~

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1楼 2016-12-11 23:42:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

mochenmi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 许彦 at 2016-12-12 21:16:39
也不一定，你记录好应该也行，你有没有具体怎么稀释的比例，还有就是你用的什么设备。

稀释比例是10x，20x，50x，100x，500x。因为我感觉cDNA不像质粒那么好，所以没有按10倍的梯度，应该也可以的吧？
仪器使用的bio-rad CFX96

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7楼2016-12-12 21:50:28
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mochenmi

铜虫 (小有名气)
300太高了吧，是不是构建的曲线有问题？我当时是180左右，然后pcr程序从三步法变成两步法降成了110左右。

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16楼2016-12-25 17:30:43
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mochenmi

铜虫 (小有名气)
请各位高手解答…

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2楼2016-12-11 23:43:50
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许彦

木虫 (正式写手)
是不是没有稀释好。

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3楼2016-12-12 15:06:49
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mochenmi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 许彦 at 2016-12-12 15:06:49
是不是没有稀释好。

我是按照反转录盒最大量反转录的（5ug），然后从10倍稀释到了500倍。5个稀释倍数做的标准曲线。

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4楼2016-12-12 16:49:24
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许彦

木虫 (正式写手)
那你就稀释错了，只能10倍100倍1000倍这样稀释。

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5楼2016-12-12 21:15:46
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许彦

木虫 (正式写手)
也不一定，你记录好应该也行，你有没有具体怎么稀释的比例，还有就是你用的什么设备。

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6楼2016-12-12 21:16:39
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-26 07:43:55
说明引物特异性不好，优化引物浓度和退火温度，或者换引物

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8楼2016-12-12 22:16:35
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
稀释比例一般是5倍或者10倍等比稀释，你这梯度太奇怪了

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9楼2016-12-12 22:17:44
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mochenmi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Ivy尘 at 2016-12-12 22:17:44
稀释比例一般是5倍或者10倍等比稀释，你这梯度太奇怪了

第一次知道要做这个，以前都是直接2-（deta,deta）Ct算结果了。想问下相对定量到底需不需要做这个？有人说要有人说不要，我怕到时候投稿编辑问我要扩增效率的数据。

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10楼2016-12-12 23:49:07
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