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酶切连接不成功 已有1人参与
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我想构建一个发夹结构用于RNAi，把长片段插入T载体(下游引物上有ClaI酶切位点），然后通过XhoI和ClaI双酶切短片段（上游引物加了XhoI，下游引物加ClaI）和长片段质粒，NEB的内切酶，酶切了一个小时，然后胶回收，用的promega T4连接酶连接，室温2h，然后转化，可是筛选出来的都只有长片段，没有短片段，说明连接没成功，是哪里的问题呢？ 发夹结构是不是长片段用正向，短片段用反向插入的，不然接头对不上啊，但是没有成功？我怕自己搞错了方向，后来没有把短片段连T载体，直接把PCR产物胶回收后双酶切了，还是没有成功。我又把筛选的反向插入的长片段作为模板，扩增短片段，然后把PCR产物双酶切，可是还是不成功，到底是为什么啊 @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端 |
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3楼2016-10-13 12:00:53
饿的神啊
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4楼2016-10-13 21:44:22
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楼主，你好，我最近构建表达载体，也用到了和你的差不多的技术，我可以请教你一下吗？酶切之后连接完了不可以直接PCR验证吗？为什么还要做转化呢？是不是因为连接后的反应液太少，然后转化扩繁要增大量呢？ 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-10-22 21:59:59
