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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提质粒酶切
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echochen1017

新虫 (初入文坛)

[求助] 提质粒酶切

1、从BL21-pET28a-gene中提取质粒，有的提不出来，然后对提出来的酶切，pET28a居然在一个小时左右被切碎（电泳无条带，只有瀑布状的东西）。
2、将目的基因与pET28a连接，转化入BL21中，抗性筛选出菌落，培养，蛋白表达（量少，基本不表达），酶活检测，对底物具有活性，且重复三次结果一致，呈现质粒构建成功的状态，但是提质粒后，却没有条带，求大神解答！！
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1楼 2013-06-02 13:24:41
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-05 12:00:01
我觉得不适合从BL21菌株中提取质粒，BL21是个表达菌株，不妨可以分析一下其基因型，基因型如下：
BL21(DE3)
F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

DH5α
F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ–

通过将BL21(DE3)与DH5α比较，你会发现，BL21（DE3）中存在endA1和 recA1，这两个基因中前者编码核酸内切酶，后者编码重组酶，也就是说质粒转进BL21是不稳定的即容易被降解和重组

所以你从BL21中提取质粒，有的提不出来，对提出来的酶切，在一个小时左右被切碎（电泳无条带，只有瀑布状的东西）是很正常的

[ Last edited by gyesang on 2013-6-2 at 16:17 ]
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4楼2013-06-02 15:08:57
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by echochen1017 at 2013-06-02 21:07:06
那我要验证质粒是否转入，不通过提质粒验证还可以怎么验证呢？...

实在要验证可以做菌落PCR
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9楼2013-06-03 10:42:25
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
echochen1017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-02 15:01:14
提质粒没有条带最可能的原因是你提的质粒浓度太低，原因可能是你的溶液二不新鲜，或者溶液三出了问题，建议重新配置溶液二和三，如果你是用碱变性法提质粒的话
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2楼2013-06-02 14:41:54
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2013-06-02 14:41:54
提质粒没有条带最可能的原因是你提的质粒浓度太低，原因可能是你的溶液二不新鲜，或者溶液三出了问题，建议重新配置溶液二和三，如果你是用碱变性法提质粒的话

我用的试剂盒提取的
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3楼2013-06-02 14:59:57
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by echochen1017 at 2013-06-02 14:59:57
我用的试剂盒提取的...

我们抽质粒一般是手抽的 浓度还可以 3000-4000ng/ul 纯度可能低点，试剂盒抽的话普遍比较低 几百的样子 如果浓度低的话 你跑电泳跑个3-4ul是跑不出来的
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5楼2013-06-02 15:15:57
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-06-02 15:08:57
我觉得不适合从BL21菌株中提取质粒，BL21是个表达菌株，不妨可以分析一下其基因型，基因型如下：
BL21(DE3)
F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 )

DH5α
F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA ...

那我要验证质粒是否转入，不通过提质粒验证还可以怎么验证呢？
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6楼2013-06-02 21:07:06
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燕子9883

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
6楼: Originally posted by echochen1017 at 2013-06-02 21:07:06
那我要验证质粒是否转入，不通过提质粒验证还可以怎么验证呢？...

BL21本身无抗性，你pet28有抗性的，抗生素筛选时就可以验证了。提质粒一般会用DH5α或者Top10，质粒拷贝数高，BL21适用于表达，质粒拷贝数不够。
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7楼2013-06-02 22:26:12
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 燕子9883 at 2013-06-02 22:26:12
BL21本身无抗性，你pet28有抗性的，抗生素筛选时就可以验证了。提质粒一般会用DH5α或者Top10，质粒拷贝数高，BL21适用于表达，质粒拷贝数不够。...

但是，也不应该30μl上样量也一点没有啊？
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8楼2013-06-03 09:37:13
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gyesang

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引用回帖:
8楼: Originally posted by echochen1017 at 2013-06-03 09:37:13
但是，也不应该30μl上样量也一点没有啊？...

问题都跟你解释清楚了，还在纠结？
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10楼2013-06-03 10:43:08
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