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echochen1017新虫 (初入文坛)
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[求助]
提质粒酶切
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1、从BL21-pET28a-gene中提取质粒，有的提不出来，然后对提出来的酶切，pET28a居然在一个小时左右被切碎（电泳无条带，只有瀑布状的东西）。 2、将目的基因与pET28a连接，转化入BL21中，抗性筛选出菌落，培养，蛋白表达（量少，基本不表达），酶活检测，对底物具有活性，且重复三次结果一致，呈现质粒构建成功的状态，但是提质粒后，却没有条带，求大神解答！！ |
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gyesang
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-05 12:00:01
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我觉得不适合从BL21菌株中提取质粒，BL21是个表达菌株，不妨可以分析一下其基因型，基因型如下： BL21(DE3) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) DH5α F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ– 通过将BL21(DE3)与DH5α比较，你会发现，BL21（DE3）中存在endA1和 recA1，这两个基因中前者编码核酸内切酶，后者编码重组酶，也就是说质粒转进BL21是不稳定的即容易被降解和重组 所以你从BL21中提取质粒，有的提不出来，对提出来的酶切，在一个小时左右被切碎（电泳无条带，只有瀑布状的东西）是很正常的 [ Last edited by gyesang on 2013-6-2 at 16:17 ] |
4楼2013-06-02 15:08:57
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9楼2013-06-03 10:42:25
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8楼2013-06-03 09:37:13
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10楼2013-06-03 10:43:08
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