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饿的神啊新虫 (著名写手)
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酶切连接不成功 已有1人参与
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我想构建一个发夹结构用于RNAi，把长片段插入T载体(下游引物上有ClaI酶切位点），然后通过XhoI和ClaI双酶切短片段（上游引物加了XhoI，下游引物加ClaI）和长片段质粒，NEB的内切酶，酶切了一个小时，然后胶回收，用的promega T4连接酶连接，室温2h，然后转化，可是筛选出来的都只有长片段，没有短片段，说明连接没成功，是哪里的问题呢？ 发夹结构是不是长片段用正向，短片段用反向插入的，不然接头对不上啊，但是没有成功？我怕自己搞错了方向，后来没有把短片段连T载体，直接把PCR产物胶回收后双酶切了，还是没有成功。我又把筛选的反向插入的长片段作为模板，扩增短片段，然后把PCR产物双酶切，可是还是不成功，到底是为什么啊 @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端 |
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楼主，你好，我最近构建表达载体，也用到了和你的差不多的技术，我可以请教你一下吗？酶切之后连接完了不可以直接PCR验证吗？为什么还要做转化呢？是不是因为连接后的反应液太少，然后转化扩繁要增大量呢？ 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-10-22 21:59:59
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2楼2016-10-13 11:32:25
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3楼2016-10-13 12:00:53
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4楼2016-10-13 21:44:22
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6楼2016-10-30 23:17:53
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7楼2016-10-31 00:17:27
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谢谢你的解答，我还有个问题，因为我把目的片段插入载体之后是要通过PEG介导的原生质体转化法进行下一步实验，而这一步需要线性化得DNA片段，那我把我构建的表达载体单酶切线性化后还会影响表达载体的表达吗？谢谢 发自小木虫Android客户端 |
8楼2016-10-31 08:57:55
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如果你需要把载体转染到细胞表达的话，就需要成环的质粒，只有在超螺旋状态才能进去透过细胞，线性片段就很难通过细胞膜。所以不需要切开。当然你的下有研究我不是很清楚 发自小木虫IOS客户端 |
9楼2016-10-31 11:54:39
10楼2016-10-31 15:07:00