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王旭昉

银虫 (小有名气)

[求助] 基因构建到表达载体上一直检测不到过表达 已有4人参与

今年上半年购买了一个基因的克隆载体,然后交给外包公司,让他们把CDS序列连接到表达载体上面,目的基因N端加了一小段柔性肽和HA标签,后面通过包装慢病毒感染细胞,一直不能检测到HA,换了蛋白本身的的抗体也检测不到蛋白,细胞内和细胞外都没有,想请问一下这个过表达体系是不是哪里缺少东西出了问题? 之后老师建议把克隆载体直接转染到细胞当中,这样能表达蛋白么,还是应该把构建好的表达载体转染到细胞当中?
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王旭昉

银虫 (小有名气)

xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-10 09:59:50
引用回帖:
3楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2016-10-09 10:28:19
把构建好的表达载体转染到细胞中,转染48-72h后检测细胞上清、细胞裂解液及沉淀看表达情况。

你说的意思是做一个瞬时表达,单转染表达载体,然后检测蛋白的情况。
我就是我
4楼2016-10-09 12:53:44
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-09 22:33:16
xn8008: 应助指数+1 2016-10-10 10:00:10
王旭昉: 金币+15, ★★★很有帮助 2016-10-13 10:11:36
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王旭昉 at 2016-10-09 12:53:44
你说的意思是做一个瞬时表达,单转染表达载体,然后检测蛋白的情况。...

先顺转293系列细胞,然后做WB,看看是不是有表达。如果有表达,再考虑是不是病毒质粒的问题。我做病毒做的很多,so,可以站短我你的q,交流详细问题比较方便。
6楼2016-10-09 18:57:14
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匿名

用户注销 (著名写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 10:00:59
本帖仅楼主可见
9楼2016-10-09 22:41:15
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普通回帖

王旭昉

银虫 (小有名气)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 09:53:32
目的基因大概1300bp,表达载体是PLVTH 约13000bp
我就是我
2楼2016-10-08 15:59:26
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 09:55:15
xn8008: 应助指数+1 2016-10-10 09:55:22
王旭昉: 金币+15, ★★★很有帮助 2016-10-13 10:11:48
把构建好的表达载体转染到细胞中,转染48-72h后检测细胞上清、细胞裂解液及沉淀看表达情况。
3楼2016-10-09 10:28:19
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-10-09 22:32:54
xn8008: 应助指数+1 2016-10-10 10:00:02
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王旭昉 at 2016-10-09 12:53:44
你说的意思是做一个瞬时表达,单转染表达载体,然后检测蛋白的情况。...

嗯,你现在是包装后的毒液感染细胞检测不到表达,不好说是哪里出了问题。只能先看看表达质粒的表达情况了。另外,你需要验证你的转染效率,这样才能保证病毒包装的效率。
5楼2016-10-09 15:40:49
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王旭昉

银虫 (小有名气)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 10:00:16
引用回帖:
5楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2016-10-09 15:40:49
嗯,你现在是包装后的毒液感染细胞检测不到表达,不好说是哪里出了问题。只能先看看表达质粒的表达情况了。另外,你需要验证你的转染效率,这样才能保证病毒包装的效率。...

是的,做了空白对照的,没有连接目的基因的表达载体上是带有GFP 荧光的,后面通过荧光检测对照组慢病毒的转染效率应该是大于80%的,实验组把GFP切掉了,所以只能检测目的蛋白,就一直检测不到表达。
我就是我
7楼2016-10-09 19:18:48
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匿名

用户注销 (著名写手)


感谢参与,应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 10:00:24
xn8008: 应助指数+1 2016-10-10 10:00:32
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8楼2016-10-09 22:39:46
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 10:01:05
引用回帖:
7楼: Originally posted by 王旭昉 at 2016-10-09 19:18:48
是的,做了空白对照的,没有连接目的基因的表达载体上是带有GFP 荧光的,后面通过荧光检测对照组慢病毒的转染效率应该是大于80%的,实验组把GFP切掉了,所以只能检测目的蛋白,就一直检测不到表达。...

你的目的蛋白会不会稳定性很差?有没有切除GFP之前检测?
10楼2016-10-10 09:10:44
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