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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 基因构建到表达载体上一直检测不到过表达
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王旭昉

银虫 (小有名气)

[求助] 基因构建到表达载体上一直检测不到过表达 已有4人参与

今年上半年购买了一个基因的克隆载体，然后交给外包公司，让他们把CDS序列连接到表达载体上面，目的基因N端加了一小段柔性肽和HA标签，后面通过包装慢病毒感染细胞，一直不能检测到HA，换了蛋白本身的的抗体也检测不到蛋白，细胞内和细胞外都没有，想请问一下这个过表达体系是不是哪里缺少东西出了问题？ 之后老师建议把克隆载体直接转染到细胞当中，这样能表达蛋白么，还是应该把构建好的表达载体转染到细胞当中？
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我就是我
1楼 2016-10-08 15:56:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

王旭昉

银虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-10 09:59:50
引用回帖:
3楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2016-10-09 10:28:19
把构建好的表达载体转染到细胞中，转染48-72h后检测细胞上清、细胞裂解液及沉淀看表达情况。

你说的意思是做一个瞬时表达，单转染表达载体，然后检测蛋白的情况。
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我就是我
4楼2016-10-09 12:53:44
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-09 22:33:16
xn8008: 应助指数+1 2016-10-10 10:00:10
王旭昉: 金币+15, ★★★很有帮助 2016-10-13 10:11:36
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王旭昉 at 2016-10-09 12:53:44
你说的意思是做一个瞬时表达，单转染表达载体，然后检测蛋白的情况。...

先顺转293系列细胞，然后做WB，看看是不是有表达。如果有表达，再考虑是不是病毒质粒的问题。我做病毒做的很多，so，可以站短我你的q，交流详细问题比较方便。
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6楼2016-10-09 18:57:14
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匿名

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★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 10:00:59
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9楼2016-10-09 22:41:15
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普通回帖

王旭昉

银虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 09:53:32
目的基因大概1300bp，表达载体是PLVTH 约13000bp
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我就是我
2楼2016-10-08 15:59:26
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 09:55:15
xn8008: 应助指数+1 2016-10-10 09:55:22
王旭昉: 金币+15, ★★★很有帮助 2016-10-13 10:11:48
把构建好的表达载体转染到细胞中，转染48-72h后检测细胞上清、细胞裂解液及沉淀看表达情况。
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3楼2016-10-09 10:28:19
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-10-09 22:32:54
xn8008: 应助指数+1 2016-10-10 10:00:02
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王旭昉 at 2016-10-09 12:53:44
你说的意思是做一个瞬时表达，单转染表达载体，然后检测蛋白的情况。...

嗯，你现在是包装后的毒液感染细胞检测不到表达，不好说是哪里出了问题。只能先看看表达质粒的表达情况了。另外，你需要验证你的转染效率，这样才能保证病毒包装的效率。
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5楼2016-10-09 15:40:49
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王旭昉

银虫 (小有名气)
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 10:00:16
引用回帖:
5楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2016-10-09 15:40:49
嗯，你现在是包装后的毒液感染细胞检测不到表达，不好说是哪里出了问题。只能先看看表达质粒的表达情况了。另外，你需要验证你的转染效率，这样才能保证病毒包装的效率。...

是的，做了空白对照的，没有连接目的基因的表达载体上是带有GFP 荧光的，后面通过荧光检测对照组慢病毒的转染效率应该是大于80%的，实验组把GFP切掉了，所以只能检测目的蛋白，就一直检测不到表达。
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我就是我
7楼2016-10-09 19:18:48
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匿名

用户注销 (著名写手)
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 10:00:24
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8楼2016-10-09 22:39:46
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 10:01:05
引用回帖:
7楼: Originally posted by 王旭昉 at 2016-10-09 19:18:48
是的，做了空白对照的，没有连接目的基因的表达载体上是带有GFP 荧光的，后面通过荧光检测对照组慢病毒的转染效率应该是大于80%的，实验组把GFP切掉了，所以只能检测目的蛋白，就一直检测不到表达。...

你的目的蛋白会不会稳定性很差？有没有切除GFP之前检测？
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10楼2016-10-10 09:10:44
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