| 查看: 3690 | 回复: 6 | |||
[求助]
有关pPICZA、pPIC9K酵母表达质粒如何正确构建载体表达蛋白已有1人参与
|
|
各位大神好，最近准备用pPICZA和pPIC9K表达一个酶，由于之前没有成功表达蛋白，所以想请教大家。 首先我在NCBI上找到我的酶的CDS区域，包括ATG和终止子，然后准备把完整的CDS区域连接到酵母表达载体pPICZA和pPIC9K上面，分别试着进行胞外和胞内表达。 1.想请问一下这个做法正确吗？要想表达一个蛋白是否只需要把它的CDS区域连入表达质粒然后在酵母中同源重组诱导后就能表达？ 2.还有就是为了防止移码突变，我该如何将我完整的CDS区域插入这两个载体中？从载体的AOX启动子那边开始阅读的话到底从哪里开始算起？ 3.pPICZA这个载体手册里面写到说插入的片段必须含有ATG这个起始子作为酵母共识别序列的一部分，我插入目的蛋白完整的CDS开头就含有ATG，是否还需要添加一个ATG？ 4.pPICZA这个载体使用说明里面还说道，要将你的基因表达为一个重组的融合蛋白的话，必须是你的基因与C端多肽（c-myc,组氨酸纯化标签）读码框一致，这样的话是不是说只要使插入的完整的CDS基因片段与后面的标签读码框一致，即3个3个翻译顺序一致就行了？那还需要考虑上游AOX的读码框顺序吗？ 5.pPIC9K这个载体说明书里面说目的基因的ORF（开放式阅读框）要与α-factor signal sequence这个信号肽序列读码框一致并且在它的下方，请问这个ORF就是我在NCBI里面找到的CDS区域吗？这里还需要考虑AOX阅读的问题吗？ 由于分子基础知识为零，真的麻烦大神指点一下啊！  ppicza.png |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白表达纯化鉴定精华 |
» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有277人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
2楼2016-01-18 21:58:27
3楼2016-01-19 11:47:38
4楼2016-01-19 13:14:30
5楼2016-01-19 14:57:40
6楼2016-10-15 21:31:24
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
肉肉肉.: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 虽然已经解决了但还是感激！ 2016-10-16 13:19:32
肉肉肉.: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 虽然已经解决了但还是感激！ 2016-10-16 13:19:32
|
不用考虑axo序列，有atg就不用额外加了 发自小木虫Android客户端 |
7楼2016-10-15 21:32:37