[求助] 有关pPICZA、pPIC9K酵母表达质粒如何正确构建载体表达蛋白 已有1人参与

各位大神好，最近准备用pPICZA和pPIC9K表达一个酶，由于之前没有成功表达蛋白，所以想请教大家。 首先我在NCBI上找到我的酶的CDS区域，包括ATG和终止子，然后准备把完整的CDS区域连接到酵母表达载体pPICZA和pPIC9K上面，分别试着进行胞外和胞内表达。 1.想请问一下这个做法正确吗？要想表达一个蛋白是否只需要把它的CDS区域连入表达质粒然后在酵母中同源重组诱导后就能表达？ 2.还有就是为了防止移码突变，我该如何将我完整的CDS区域插入这两个载体中？从载体的AOX启动子那边开始阅读的话到底从哪里开始算起？ 3.pPICZA这个载体手册里面写到说插入的片段必须含有ATG这个起始子作为酵母共识别序列的一部分，我插入目的蛋白完整的CDS开头就含有ATG，是否还需要添加一个ATG？ 4.pPICZA这个载体使用说明里面还说道，要将你的基因表达为一个重组的融合蛋白的话，必须是你的基因与C端多肽（c-myc,组氨酸纯化标签）读码框一致，这样的话是不是说只要使插入的完整的CDS基因片段与后面的标签读码框一致，即3个3个翻译顺序一致就行了？那还需要考虑上游AOX的读码框顺序吗？ 5.pPIC9K这个载体说明书里面说目的基因的ORF（开放式阅读框）要与α-factor signal sequence这个信号肽序列读码框一致并且在它的下方，请问这个ORF就是我在NCBI里面找到的CDS区域吗？这里还需要考虑AOX阅读的问题吗？ 由于分子基础知识为零，真的麻烦大神指点一下啊！ ppicza.png

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蛋白表达纯化鉴定精华

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