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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组为模板pcr
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新虫 (初入文坛)

[求助] 基因组为模板pcr 已有3人参与

提基因组跑胶在比15000大一点的地方条带很亮（15000marker），然后以基因组为模板pcr，用的是takara primerstar(premix)，第一次94度预变性1分钟，94度变性10s，55度退火5s，72延伸1分钟，跑胶结果在750bp左右亮了，第二次98度预变性3分钟，98度变性10s，其他不变，跑胶结果100bp左右亮了，目的条带1100bp，这是为什么？？

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1楼 2016-09-27 21:38:12
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Tc148

新虫 (初入文坛)
100bp的应该是引物二聚体，为啥要换变性温度？

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2楼2016-09-27 21:51:54
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新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by Tc148 at 2016-09-27 21:51:54
100bp的应该是引物二聚体，为啥要换变性温度？

因为这个酶说明书上是98度

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3楼2016-09-27 22:14:08
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Tc148

新虫 (初入文坛)
得检查退火温度，你的产物gc含量高么？

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4楼2016-09-27 22:33:25
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新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by Tc148 at 2016-09-27 22:33:25
得检查退火温度，你的产物gc含量高么？

40%多

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5楼2016-09-27 22:41:35
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Tc148

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 新人求帮助 at 2016-09-27 22:41:35
40%多
...

这个gc含量还好了，调整一下退火温度吧。也可以考虑先用内切酶处理一下模板再做扩增，选产物上没有的酶切位点就好。

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6楼2016-09-28 06:13:42
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新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by Tc148 at 2016-09-28 06:13:42
这个gc含量还好了，调整一下退火温度吧。也可以考虑先用内切酶处理一下模板再做扩增，选产物上没有的酶切位点就好。
...

忘了说了，我做的是梯度，52 55和58三个温度，引物Tm值分别为55和59

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7楼2016-09-28 07:54:41
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werq63

金虫 (著名写手)
你需要多大的结果呢？

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8楼2016-09-28 08:34:01
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新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by werq63 at 2016-09-28 08:34:01
你需要多大的结果呢？

目的基因是1100bp啊

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9楼2016-09-28 09:07:49
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
按照mix的说明书   把基因组稀释一下    mix对基因组做模板浓度要求特别高 基因组做模板 不介意用mix   用phusion吧

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10楼2016-09-28 10:17:16
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