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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。
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王栋

铜虫 (小有名气)

[求助] 基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。 已有12人参与

提取秀丽线虫基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，目的片段2300bp。使用Q5 高保真DNA聚合酶，25ul体系（7.25ul H2O＋5ul 5×buffer＋2ul 2.5mM dNTP＋1.25ul上游引物＋1.25ul下游引物＋3ul 模板＋5ul GC Enhancer＋0.25ul Q5酶）。第一次扩增成功，但是之后模板用没了又重新提了3次基因组DNA，始终不能扩增出目的片段，退火温度从50度到72度都试过了，不行，Taq酶也试过了，不行。

基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。
第一次扩增成功（最上面那条带） .jpg


基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。-1
最初使用的条件.png


基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。-2
后来的结果就一直是这样的.png
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1楼 2015-08-28 11:32:50
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

枭翔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-05 23:01:24
首先，看看你的模板DNA，跑个电泳看看，是不是降解。最好是重新提取一次。引物一般没啥问题，可以最后考虑。扩增体系里面加上5-10%的DMSO。可以用你第一次的产物作为模板进行扩增，这样万无一失，如果还是不行，说明你的酶可能失活了。
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19楼2015-09-02 13:44:41
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
DNA降解，或者DNA纯度不够。
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8楼2015-08-28 17:20:22
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lingonghua

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:00:18
y引物不太匹配或降解，我们实验室学生也遇到过类似情况，重新合成引物试试
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10楼2015-08-31 12:18:25
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穿白大褂约会

禁言 (小有名气)
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王栋
13楼2015-09-01 13:59:18
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chaochaosoul

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

基因组DNA不确定性太多，巢扩可以改善这个情况。重新设计一对巢扩引物，再以巢扩出来的目的片段为模板，就可以了。我自己这么p过3000多的片段

发自小木虫Android客户端
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29楼2015-09-04 12:03:25
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普通回帖

王栋

铜虫 (小有名气)
对了，在PCR之前进行了如下操作：98℃预变性3min，然后冰浴5min，然后进行PCR。求各位大神支招，我应该怎么办？是哪里处理问题？
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2楼2015-08-28 11:35:16
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-28 23:06:12
既然第一次扩出来了，说明体系应该没有问题，我认为是模板DNA的问题，有杂质影响PCR，建议重新提取DNA.
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3楼2015-08-28 11:55:05
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王栋

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-28 11:55:05
既然第一次扩出来了，说明体系应该没有问题，我认为是模板DNA的问题，有杂质影响PCR，建议重新提取DNA.

这个是我的基因组DNA跑胶的结果。我后来又提了2次，可是还是不行啊。
基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。-3
这个是基因组DNA跑的胶（5ul）.png
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4楼2015-08-28 12:08:22
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王栋

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王栋 at 2015-08-28 12:08:22
这个是我的基因组DNA跑胶的结果。我后来又提了2次，可是还是不行啊。

这个是基因组DNA跑的胶（5ul）.png
...

基因组是上面 比较淡的一条带，5ul跑的胶。大神求帮忙

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2015-08-28 12:49:38
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王栋

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 王栋 at 2015-08-28 12:49:38
基因组是上面 比较淡的一条带，5ul跑的胶。大神求帮忙
...

求各位大神帮忙，问题在哪里

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2015-08-28 14:07:30
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:00:41
大概是模板问题了，可能有些phenol或者蛋白没有去掉，影响PCR

其实你既然已经扩出来了，就干脆用PCR产物做模板重做啦

真的倒霉出突变了你就把它给改过来嘛，总比啥都不出来要好
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7楼2015-08-28 17:00:26
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wj2105

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
DNA有杂质，建议重新提，或者后期储存过程中出现差错
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女博一枚
9楼2015-08-31 11:15:45
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