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王栋

铜虫 (小有名气)

[求助] 基因组DNA为模板进行PCR,第一次扩出来了,后面怎么重复都不行。 已有12人参与

提取秀丽线虫基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,目的片段2300bp。使用Q5 高保真DNA聚合酶,25ul体系(7.25ul H2O+5ul 5×buffer+2ul 2.5mM dNTP+1.25ul上游引物+1.25ul下游引物+3ul 模板+5ul GC Enhancer+0.25ul Q5酶)。第一次扩增成功,但是之后模板用没了又重新提了3次基因组DNA,始终不能扩增出目的片段,退火温度从50度到72度都试过了,不行,Taq酶也试过了,不行。

基因组DNA为模板进行PCR,第一次扩出来了,后面怎么重复都不行。
第一次扩增成功(最上面那条带) .jpg


基因组DNA为模板进行PCR,第一次扩出来了,后面怎么重复都不行。-1
最初使用的条件.png


基因组DNA为模板进行PCR,第一次扩出来了,后面怎么重复都不行。-2
后来的结果就一直是这样的.png
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
DNA降解,或者DNA纯度不够。
8楼2015-08-28 17:20:22
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王栋

铜虫 (小有名气)

对了,在PCR之前进行了如下操作:98℃预变性3min,然后冰浴5min,然后进行PCR。求各位大神支招,我应该怎么办?是哪里处理问题?
2楼2015-08-28 11:35:16
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-28 23:06:12
既然第一次扩出来了,说明体系应该没有问题,我认为是模板DNA的问题,有杂质影响PCR,建议重新提取DNA.
3楼2015-08-28 11:55:05
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王栋

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-28 11:55:05
既然第一次扩出来了,说明体系应该没有问题,我认为是模板DNA的问题,有杂质影响PCR,建议重新提取DNA.

这个是我的基因组DNA跑胶的结果。我后来又提了2次,可是还是不行啊。
基因组DNA为模板进行PCR,第一次扩出来了,后面怎么重复都不行。-3
这个是基因组DNA跑的胶(5ul).png

4楼2015-08-28 12:08:22
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