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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。
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王栋

铜虫 (小有名气)
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19楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-02 13:44:41
首先，看看你的模板DNA，跑个电泳看看，是不是降解。最好是重新提取一次。引物一般没啥问题，可以最后考虑。扩增体系里面加上5-10%的DMSO。可以用你第一次的产物作为模板进行扩增，这样万无一失，如果还是不行，说明 ...

谢谢前辈~最近重新提了DNA,发现是因为之前提DNA没有除RNA的原因。但是PCR产物浓度不高，该怎么解决呢？谢谢前辈~

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21楼2015-09-03 22:41:51
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王栋

铜虫 (小有名气)
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15楼: Originally posted by ufo29119690 at 2015-09-02 06:33:28
应该是后来提取的DNA质量不好  有降解 或者浓度低

谢谢前辈~最近重新提了DNA,发现是因为之前提DNA没有除RNA的原因。但是PCR产物浓度不高，该怎么解决呢？谢谢前辈~

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22楼2015-09-03 22:42:11
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王栋

铜虫 (小有名气)
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16楼: Originally posted by 327351493 at 2015-09-02 07:43:13
重新换一批新的引物，酶等，用第一次P的条件进行，如果能P出来，可能就是这些物质降解了，如果没P出来，可能是模板出问题了

谢谢前辈~最近重新提了DNA,发现是因为之前提DNA没有除RNA的原因。但是PCR产物浓度不高，该怎么解决呢？谢谢前辈~

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23楼2015-09-03 22:42:41
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王栋

铜虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-28 17:00:26
大概是模板问题了，可能有些phenol或者蛋白没有去掉，影响PCR

其实你既然已经扩出来了，就干脆用PCR产物做模板重做啦

真的倒霉出突变了你就把它给改过来嘛，总比啥都不出来要好

谢谢前辈~最近重新提了DNA,发现是因为之前提DNA没有除RNA的原因。但是PCR产物浓度不高，该怎么解决呢？谢谢前辈~

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24楼2015-09-03 22:44:25
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王栋

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
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13楼: Originally posted by 穿白大褂约会 at 2015-09-01 13:59:18
基因组DNA点样5ul，已经降解了！重新抽提吧！不管选择那种抽提方法，一定要严格操作，避免降解！...

谢谢前辈~最近重新提了DNA,发现是因为之前提DNA没有除RNA的原因。但是PCR产物浓度不高，该怎么解决呢？谢谢前辈~

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25楼2015-09-03 22:44:54
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yfd900825

银虫 (正式写手)
多做几管合并回收呗，不然就是优化体系了，引物浓度及退火调整一下

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26楼2015-09-03 23:15:39
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ufo29119690

金虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 王栋 at 2015-09-03 22:42:11
谢谢前辈~最近重新提了DNA,发现是因为之前提DNA没有除RNA的原因。但是PCR产物浓度不高，该怎么解决呢？谢谢前辈~
...

用PCR产物做模板 再P一次

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27楼2015-09-04 08:57:53
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chaochaosoul

新虫 (初入文坛)
试试巢扩

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28楼2015-09-04 10:01:08
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chaochaosoul

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

基因组DNA不确定性太多，巢扩可以改善这个情况。重新设计一对巢扩引物，再以巢扩出来的目的片段为模板，就可以了。我自己这么p过3000多的片段

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29楼2015-09-04 12:03:25
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枭翔

金虫 (正式写手)
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21楼: Originally posted by 王栋 at 2015-09-03 22:41:51
谢谢前辈~最近重新提了DNA,发现是因为之前提DNA没有除RNA的原因。但是PCR产物浓度不高，该怎么解决呢？谢谢前辈~
...

一般来说30个循环就足够了，如果说PCR浓度不高，是你的胶回收产物不高？还是直接PCR回收的产物浓度不高？如果是第一个，可能是胶回收的手法问题，一般来说，胶回收会损失50%。如果是第二个，那么是你的PCR条件不合适，做个touchdown吧，效果应该不错的。
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30楼2015-09-05 21:11:08
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