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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。
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王栋

铜虫 (小有名气)

[求助] 基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。 已有12人参与

提取秀丽线虫基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，目的片段2300bp。使用Q5 高保真DNA聚合酶，25ul体系（7.25ul H2O＋5ul 5×buffer＋2ul 2.5mM dNTP＋1.25ul上游引物＋1.25ul下游引物＋3ul 模板＋5ul GC Enhancer＋0.25ul Q5酶）。第一次扩增成功，但是之后模板用没了又重新提了3次基因组DNA，始终不能扩增出目的片段，退火温度从50度到72度都试过了，不行，Taq酶也试过了，不行。

基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。
第一次扩增成功（最上面那条带） .jpg


基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。-1
最初使用的条件.png


基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。-2
后来的结果就一直是这样的.png
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1楼 2015-08-28 11:32:50
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枭翔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 王栋 at 2015-09-03 22:41:51
谢谢前辈~最近重新提了DNA,发现是因为之前提DNA没有除RNA的原因。但是PCR产物浓度不高，该怎么解决呢？谢谢前辈~
...

一般来说30个循环就足够了，如果说PCR浓度不高，是你的胶回收产物不高？还是直接PCR回收的产物浓度不高？如果是第一个，可能是胶回收的手法问题，一般来说，胶回收会损失50%。如果是第二个，那么是你的PCR条件不合适，做个touchdown吧，效果应该不错的。
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30楼2015-09-05 21:11:08
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王栋

铜虫 (小有名气)
对了，在PCR之前进行了如下操作：98℃预变性3min，然后冰浴5min，然后进行PCR。求各位大神支招，我应该怎么办？是哪里处理问题？
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2楼2015-08-28 11:35:16
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-28 23:06:12
既然第一次扩出来了，说明体系应该没有问题，我认为是模板DNA的问题，有杂质影响PCR，建议重新提取DNA.
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3楼2015-08-28 11:55:05
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王栋

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2015-08-28 11:55:05
既然第一次扩出来了，说明体系应该没有问题，我认为是模板DNA的问题，有杂质影响PCR，建议重新提取DNA.

这个是我的基因组DNA跑胶的结果。我后来又提了2次，可是还是不行啊。
基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。-3
这个是基因组DNA跑的胶（5ul）.png
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4楼2015-08-28 12:08:22
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