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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。
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王栋

铜虫 (小有名气)

[求助] 基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。已有12人参与

提取秀丽线虫基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，目的片段2300bp。使用Q5 高保真DNA聚合酶，25ul体系（7.25ul H2O＋5ul 5×buffer＋2ul 2.5mM dNTP＋1.25ul上游引物＋1.25ul下游引物＋3ul 模板＋5ul GC Enhancer＋0.25ul Q5酶）。第一次扩增成功，但是之后模板用没了又重新提了3次基因组DNA，始终不能扩增出目的片段，退火温度从50度到72度都试过了，不行，Taq酶也试过了，不行。

基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。
第一次扩增成功（最上面那条带） .jpg


基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。-1
最初使用的条件.png


基因组DNA为模板进行PCR，第一次扩出来了，后面怎么重复都不行。-2
后来的结果就一直是这样的.png
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1楼2015-08-28 11:32:50
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枭翔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-05 23:01:24
首先，看看你的模板DNA，跑个电泳看看，是不是降解。最好是重新提取一次。引物一般没啥问题，可以最后考虑。扩增体系里面加上5-10%的DMSO。可以用你第一次的产物作为模板进行扩增，这样万无一失，如果还是不行，说明你的酶可能失活了。
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19楼2015-09-02 13:44:41
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枭翔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 王栋 at 2015-09-03 22:41:51
谢谢前辈~最近重新提了DNA,发现是因为之前提DNA没有除RNA的原因。但是PCR产物浓度不高，该怎么解决呢？谢谢前辈~
...

一般来说30个循环就足够了，如果说PCR浓度不高，是你的胶回收产物不高？还是直接PCR回收的产物浓度不高？如果是第一个，可能是胶回收的手法问题，一般来说，胶回收会损失50%。如果是第二个，那么是你的PCR条件不合适，做个touchdown吧，效果应该不错的。
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30楼2015-09-05 21:11:08
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枭翔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
31楼: Originally posted by 王栋 at 2015-09-06 08:22:47
前辈能不能给个建议，如何设置touch down的参数，对这方面不是很了解~
...

你百度一下吧，根据自己的需要设置参数
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33楼2015-09-06 17:49:03
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