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zlh1225

铜虫 (正式写手)

[交流] 双酶切和质粒PCR验证结果不一样 已有10人参与

最近构建1个载体,目的基因大小是1800多bp。经过扩增pcr、双酶切、酶连、转化等步骤之后,均通过电泳验证。然后摇菌提质粒,进行质粒pcr和双酶切验证,结果质粒pcr扩增出来目的条带了,而且还挺亮,但是双酶切就是切不出来,重复了两次还是不行,请问哪位专家能不能指点一下到底怎么回事啊??????

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化学
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X小天T

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
质粒双酶切对浓度要求比较大,可以加大质粒浓度,适当延长酶切时间试试

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4楼2016-04-25 00:38:19
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普通回帖

zlh1225

铜虫 (正式写手)

测序公司说空载,是自己问题还是测序公司问题???

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化学
2楼2016-04-24 00:31:36
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Liumengya

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
有可能pcr结果片段刚好是载体上的片段…你用的是什么引物

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3楼2016-04-24 23:02:07
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖内容被屏蔽

5楼2016-04-25 07:52:12
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zlh1225

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by X小天T at 2016-04-25 00:38:19
质粒双酶切对浓度要求比较大,可以加大质粒浓度,适当延长酶切时间试试

质粒是PET28a,很稳定成熟的路线

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化学
6楼2016-04-25 08:13:06
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zlh1225

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Eternity宇 at 2016-04-25 07:52:12
也有可能是转进去了,没连上

这种情况在Top10感受态菌还可以生长?

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化学
7楼2016-04-25 08:14:45
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zlh1225

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Liumengya at 2016-04-24 23:02:07
有可能pcr结果片段刚好是载体上的片段…你用的是什么引物

第一步PCR引物和后面质粒验证时PCR引物一致,都是针对目的基因片段!质粒酶切位点是Nco1和Nhe1

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化学
8楼2016-04-25 08:18:09
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家喻户晓

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你用空载和你的质粒一块跑个胶,看看大小,不行的话就分别把空载和质粒单酶切,然后跑个电泳看一下条带大小

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9楼2016-04-25 08:21:48
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zlh1225

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 家喻户晓 at 2016-04-25 08:21:48
你用空载和你的质粒一块跑个胶,看看大小,不行的话就分别把空载和质粒单酶切,然后跑个电泳看一下条带大小

好的!有没有可能我提取的质粒携带全基因组,然后pcr给P出来了?

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化学
10楼2016-04-25 08:42:37
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