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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切和质粒PCR验证结果不一样
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zlh1225

铜虫 (正式写手)

[交流] 双酶切和质粒PCR验证结果不一样 已有10人参与

最近构建1个载体，目的基因大小是1800多bp。经过扩增pcr、双酶切、酶连、转化等步骤之后，均通过电泳验证。然后摇菌提质粒，进行质粒pcr和双酶切验证，结果质粒pcr扩增出来目的条带了，而且还挺亮，但是双酶切就是切不出来，重复了两次还是不行，请问哪位专家能不能指点一下到底怎么回事啊？？？？？？

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化学
1楼 2016-04-24 00:29:17
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

X小天T

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
质粒双酶切对浓度要求比较大，可以加大质粒浓度，适当延长酶切时间试试

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4楼2016-04-25 00:38:19
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普通回帖

zlh1225

铜虫 (正式写手)
测序公司说空载，是自己问题还是测序公司问题？？？

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化学
2楼2016-04-24 00:31:36
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Liumengya

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有可能pcr结果片段刚好是载体上的片段…你用的是什么引物

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3楼2016-04-24 23:02:07
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
5楼2016-04-25 07:52:12
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zlh1225

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by X小天T at 2016-04-25 00:38:19
质粒双酶切对浓度要求比较大，可以加大质粒浓度，适当延长酶切时间试试

质粒是PET28a，很稳定成熟的路线

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化学
6楼2016-04-25 08:13:06
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zlh1225

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Eternity宇 at 2016-04-25 07:52:12
也有可能是转进去了，没连上

这种情况在Top10感受态菌还可以生长？

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化学
7楼2016-04-25 08:14:45
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zlh1225

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Liumengya at 2016-04-24 23:02:07
有可能pcr结果片段刚好是载体上的片段…你用的是什么引物

第一步PCR引物和后面质粒验证时PCR引物一致，都是针对目的基因片段！质粒酶切位点是Nco1和Nhe1

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化学
8楼2016-04-25 08:18:09
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家喻户晓

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用空载和你的质粒一块跑个胶，看看大小，不行的话就分别把空载和质粒单酶切，然后跑个电泳看一下条带大小

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9楼2016-04-25 08:21:48
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zlh1225

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 家喻户晓 at 2016-04-25 08:21:48
你用空载和你的质粒一块跑个胶，看看大小，不行的话就分别把空载和质粒单酶切，然后跑个电泳看一下条带大小

好的！有没有可能我提取的质粒携带全基因组，然后pcr给P出来了？

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化学
10楼2016-04-25 08:42:37
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