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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切连接
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[求助] 酶切连接

新手提问
xho1和sac1的双酶切问题：从T载体和表达载体分别用这两种酶双酶切，回收T载体的酶切目的片段，连接到表达载体的相应的酶切位点上，16度过夜，热击转化，过夜跳单克隆，pcr验证，有目的片段，但是提取质粒酶切没有目的片段，pcr共检测出近20个单菌落是这种情况了，但都切不出目的片段，请问我该怎么办？？？急急急
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1楼 2013-06-24 14:51:49
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
33ggdf(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-26 12:52:27
33ggdf: 金币+2, ★有帮助 2013-06-26 15:38:40
目的片段多大？验证的有多大？提的质粒浓度多大？酶切是否定量了？时间是否过少或过长?少了切不开，多了星活性。。建议从这几点改进。。祝顺利
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2楼2013-06-24 18:16:33
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
33ggdf(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-26 12:52:34
我们一般4度过夜，我觉得是没有连上，菌液PCR有不一定代表你连上了，有可能菌液里面本身就有这个基因，如果是提出的质粒为模板PCR的话应该就没有目的条带吧。
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keepon
3楼2013-06-25 08:40:51
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-06-24 18:16:33
目的片段多大？验证的有多大？提的质粒浓度多大？酶切是否定量了？时间是否过少或过长?少了切不开，多了星活性。。建议从这几点改进。。祝顺利

pcr的片段和目的片段一样大小，我有设置的对照。酶切体系50微升，含20微升质粒。酶切时间为三小时。您看有什么地方不妥吗？
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4楼2013-06-25 20:23:49
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-06-25 08:40:51
我们一般4度过夜，我觉得是没有连上，菌液PCR有不一定代表你连上了，有可能菌液里面本身就有这个基因，如果是提出的质粒为模板PCR的话应该就没有目的条带吧。

提取的质粒为模板也是有目的条带的，我现在都不知道怎么办好了，干脆去测序得了，这是我目前的想法
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5楼2013-06-25 20:25:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
33ggdf: 金币+1, ★有帮助 2013-06-26 15:38:59
建议楼主测序或者用质谱直接测定一下分子量。有事电泳测定的分子量不是很准确。
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6楼2013-06-25 21:17:55
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-06-25 20:25:26
提取的质粒为模板也是有目的条带的，我现在都不知道怎么办好了，干脆去测序得了，这是我目前的想法...

嘿嘿。。。楼主太认真了。。。我们构建好了以后挑单克隆、摇菌后直接拿去测序的，发证测序又不贵，就20元左右。。。不过楼主的认真态度值得学习。。。
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keepon
7楼2013-06-25 21:51:11
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