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33ggdf

新虫 (小有名气)

[求助] 酶切连接

新手提问
xho1和sac1的双酶切问题:从T载体和表达载体分别用这两种酶双酶切,回收T载体的酶切目的片段,连接到表达载体的相应的酶切位点上,16度过夜,热击转化,过夜跳单克隆,pcr验证,有目的片段,但是提取质粒酶切没有目的片段,pcr共检测出近20个单菌落是这种情况了,但都切不出目的片段,请问我该怎么办???急急急
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
33ggdf: 金币+1, 有帮助 2013-06-26 15:38:59
建议楼主测序或者用质谱直接测定一下分子量。有事电泳测定的分子量不是很准确。
6楼2013-06-25 21:17:55
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查看全部 7 个回答

武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
33ggdf(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-06-26 12:52:27
33ggdf: 金币+2, 有帮助 2013-06-26 15:38:40
目的片段多大?验证的有多大?提的质粒浓度多大?酶切是否定量了?时间是否过少或过长?少了切不开,多了星活性。。建议从这几点改进。。祝顺利
2楼2013-06-24 18:16:33
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
33ggdf(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-06-26 12:52:34
我们一般4度过夜,我觉得是没有连上,菌液PCR有不一定代表你连上了,有可能菌液里面本身就有这个基因,如果是提出的质粒为模板PCR的话应该就没有目的条带吧。
keepon
3楼2013-06-25 08:40:51
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33ggdf

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-06-24 18:16:33
目的片段多大?验证的有多大?提的质粒浓度多大?酶切是否定量了?时间是否过少或过长?少了切不开,多了星活性。。建议从这几点改进。。祝顺利

pcr的片段和目的片段一样大小,我有设置的对照。酶切体系50微升,含20微升质粒。酶切时间为三小时。您看有什么地方不妥吗?
4楼2013-06-25 20:23:49
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