请教各位前辈，我目前要纯化一种蛋白，无标签，约60KD，PI5.1

实验步骤如下：

样品处理：

1.组织溶于等体积标准盐溶液（含100mM Kcl）样品洗涤超声离心弃上清取沉淀，重复3次

2.沉淀复悬于5倍体积提取液（含500mmNacl）超声离心弃上清取沉淀，重复2次

3.沉淀复悬于Buffer A（10mM 磷酸二氢钠），超声后过滤膜得上柱样品

柱子为DEAE FF 1ml

平衡和洗脱缓Buffer均为磷酸二氢钠（含8M尿素），分别为10mM和1000mM,PH均为7.0

上柱前曾用BufferA(10mM)平衡20个柱体积至基线平稳，上样量为10ml

洗脱方式为梯度浓度洗脱，以2ml/min，10ml一管收集；梯度浓度设置如下

NO      时间       A%        B%
1           0         100         0
2          30         90         10
3          90         85         15
4         150        80         20  
5         240        60         40
6         300        50         50
7         360        30         70
8         390         0         100

因实验室没有电导仪，所以没有测过电导

出现的问题：
按梯度浓度收集80管样品，总是在第一管出现目的蛋白和一些杂蛋白，后续管里无任何蛋白。尝试过改变PH为6.5，7.5，8.0，结果依然如此。请教各位前辈这是没挂上柱子吗？在不换柱子得情况下有哪些可以改进的地方？ 返回小木虫查看更多