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从7天缩短至24小时！如何实现成年小鼠骨组织的“超速”EDTA脱钙？
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骨组织脱钙是病理制片和免疫组化（ihc）必需的操作步骤，也将决定实验成败。与普通软组织相比，骨组织含有丰富的钙质，结构坚硬。而脱钙是骨组织制片中容易出现问题的操作之一。提高脱钙速度，将会造成细胞结构破坏、抗原活性丢失，造成导致ihc染色阴性。而脱钙不彻底将会使石蜡切片硬脆，无法切出薄厚均匀的连续切片。 如何做到钙质去除彻底又不损害组织形态和抗原活性呢？本文将结合实验操作的痛点，总结脱钙液的特性，分享实验设计优化案例，与大家共同探讨骨组织脱钙实验的操作细节。同时，诚挚欢迎各位同仁指正交流、分享经验。 一、常见脱钙液介绍 脱钙是利用化学试剂将钙盐从骨组织中去除的过程，其原理是酸或螯合剂能够与钙盐反应。比如盐酸、硝酸、甲酸等与羟基磷灰石反应，生成可溶性的氯化钙、磷酸等，将骨组织中的钙盐溶解。又或者螯合剂（edta）能够与钙离子形成稳定的络合物，使钙盐被溶解。 常用的脱钙液可以分为edta、有机酸（甲酸等）、无机酸（硝酸等）三大类，酸类脱钙液也可以分为单一组分的酸和混合酸。10%的甲酸是使用范围较广的一种脱钙液，适合骨髓脱钙，不适用于密皮质骨。硝酸会因形成亚硝酸而是溶液变黄，常加入0.1%的尿素使其保持无色，但尿素作用时效有限，需要在硝酸显淡黄时补充。硝酸水溶液作用迅速，组织不膨胀，适用于肋骨在12-24小时内脱钙。 混合酸溶液脱钙完全、快速，可以防止纤维组织过度膨胀，减少组织破坏对染色的影响。常见的有甲酸-福尔马林溶液、硝酸-福尔马林（clayden氏液）、盐酸－氯化钠液（von ebner氏液）。  二、脱钙液浓度与处理时间的优化 骨组织完全脱钙是其组织学分析中较为耗时的操作。样本大小、实验物种的不同，造成脱钙周期短则数日、长至数月。如果脱钙方式选择不合适还会造成组织损伤。edta脱钙过程对组织损伤小但脱钙速度非常缓慢，使用弱有机酸（如甲酸）或强无机酸（如盐酸、硝酸）能够加快脱钙速度。 澳大利亚的研究团队对比四种脱钙液在三种不同温度条件下的脱钙效果。  源自文献：tissue morphology and antigenicity in mouse and rat tibia: comparing 12 different decalcification conditions 以小鼠胫骨的苏木精-伊红（he）与番红o /固绿染色结果为例。任一温度下，edta或甲酸处理后骨、软骨、骨髓及血管内细胞核无降解、模糊等异常现象，而经盐酸或硝酸处理的标本会出现不同程度的形态损伤。在he染色中，edta或甲酸处理的标本粘合线、板层骨结构完整、分界清晰，而盐酸或硝酸脱钙后边界模糊（图中箭头所示）。番红o /固绿染色切片中，骺板软骨呈亮红色，骨组织呈绿色。edta或甲酸处理的标本软骨与骨结构均保存良好，但盐酸或硝酸处理的软骨基质中出现核酸非特异性染色，细胞核偏绿色，出现软骨细胞及陷窝皱缩。  源自文献：tissue morphology and antigenicity in mouse and rat tibia: comparing 12 different decalcification conditions 结果发现小鼠和大鼠的胫骨在37℃、5%硝酸中脱钙最快，在4℃、10% edta中最慢。但是组织染色和免疫组化结果证实，4℃、25℃ edta在组织保存质量上最优。4℃、10%甲酸可作为替代方案，脱钙时长缩短90%。不推荐使用5%盐酸或硝酸。小鼠胫骨标本体积小，脱钙时间短，对高温与酸性环境的耐受性要高于大鼠。作者建议根据研究目的与标本尺寸选用替代脱钙方案，在保证组织学观察准确性的同时大幅缩短脱钙周期。 三、“超速”edta脱钙：从7天到24小时 edta作为螯合脱钙剂，在保存组织形态、抗原性和核酸方面具有优势，但脱钙速度慢也限制了其在临床和科研中的应用。在实验过程中，我们也会通过多种手段加快edta的脱钙速度，如改变温度、调整浓度、超声处理、持续振荡、微波加热等，但加速效果不显著。 2024年scientific reports发表的一项研究获得突破性结果，将原本需要7天的成年小鼠踝关节脱钙时间缩短到24小时。研究人员在26%的edta溶液中，加入5% nacl、0.5% tween-20、1% triton x-100，45℃恒温震荡处理。与室温15% edta处理的样本进行了细胞皱缩率、细胞核固缩率、ihc（cd3、cd45）、he染色、dapi染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（trap）染色、番红 o 染色、甲苯胺蓝染色、天狼星红染色、rna原位杂交等12项对比。结果显示：组织形态结构、抗原性、酶活性、与dna均能完好保留，且mrna的保留效果优于室温15% edta的脱钙方案。  源自文献：hypertonic saline and detergent accelerated edta based decalcification better preserves mrna of bones 在edta脱钙液中添加高渗盐水和去污剂，操作简便、成本低廉，无需改动现有的组织切片实验流程。高渗盐水屏蔽电荷干扰，加快水溶性edta向组织内部扩散。去污剂可清除组织离子通道周围的疏水物质、封闭亲脂基团。该方案在组织微细结构上与现有脱钙液持平，研究人员建议ihc、if、ish等实验，若时间紧迫可尝试此方案。 |
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