首先我一共要连接三个片段，直接连接表达载体，这三个片段都属于同一个基因家族，就是同源性不高，片段是pcr得到的（提取的研究材料全RNA反转录得到的cDNA），采用双酶切的方法，选取的是sal1和BamH1两个酶切位点，这两个酶切位点在载体上离得很近，序列是（GTCGAC）TCTAGA（GGATTC），只间隔了6bp，不过我通过先用sal1酶切在用BamH1酶切的方法已经连接上了两个片段，这能说明我的载体酶切肯定是没问题的吧？而且三个片段都是同一操作流程，也就是说我设计的引物也没问题吧？片段酶切也没问题吧？但是，第三个片段，也是最关键的片段，就是死活连不上去，连上那两个片段其实就用了三个星期……本来我想着，因为原来的载体酶切后不好判断酶切程度，我可以通过酶切已经连上目的片段的重组质粒，跑胶回收酶切好的载体来做连接，但是，重组质粒，一切就碎，就跟pcr的引物二聚体似的，根本没法回收，重新提了一批原始质粒和片段做酶切，用50的体系，酶各加2，酶切4小时，跑胶发现，竟然也被切碎了，然后，减小酶量，各加1，发现还是碎了，是因为这次用的大体系酶切么？我之前酶切用的25的体系……求各位大神帮忙分析一下，描述比较混乱，我现在特别绝望……

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