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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 抗体与核酸共价连接，sulfo-SMCC做交联剂
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sysg07124

新虫 (初入文坛)

[求助] 抗体与核酸共价连接，sulfo-SMCC做交联剂 已有1人参与

现在做一个需要将抗体和核酸共价连接的实验，sulfo-SMCC做交联剂，开始用SMCC先活化抗体（室温2小时），然后用DTT还原巯基DNA（37℃ 1小时），分别过脱盐柱后混合透析，得到的产物跑SDS-PAGE，考蓝染色，在泳道的最顶端出现了条带（与marker相比分子量超过了250 kDa）。经验证，SMCC只与抗体混合，室温静置半小时就可以在泳道上端产生明显的条带，应该是抗体之间发生了交联。
然后又考虑用氨基的探针先与SMCC室温震荡孵育3小时，然后再与抗体孵育过夜，SDS-PAGE，考蓝染色，条带与纯抗体的对照完全没有差别。问题到底出在哪里，谁有具体的实验步骤可供参考？

抗体与核酸共价连接，sulfo-SMCC做交联剂
附件1.jpg@biostar2009
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1楼 2017-10-02 20:04:44
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眼睛儿

新虫 (小有名气)
你这个电泳跑的漂亮

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2楼2017-10-02 20:19:54
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petty04

新虫 (职业作家)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-10-02 23:25:52
产生抗体与抗体的偶联应该是不可避免的，可能你需要计算好蛋白和核酸的摩尔比，用摩尔比远过量的巯基核酸做反应试试看，应该会一定程度上降低蛋白之间的偶联。另外，反应时尽量把蛋白调到较低浓度，降低蛋白互相之间碰撞偶联的几率

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sysg07124
3楼2017-10-02 20:32:51
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minecat

木虫 (初入文坛)
全程在缓冲液中加入螯合剂EDTA试试。

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4楼2017-10-02 20:42:32
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sysg07124

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by petty04 at 2017-10-02 20:32:51
产生抗体与抗体的偶联应该是不可避免的，可能你需要计算好蛋白和核酸的摩尔比，用摩尔比远过量的巯基核酸做反应试试看，应该会一定程度上降低蛋白之间的偶联。另外，反应时尽量把蛋白调到较低浓度，降低蛋白互相之间 ...

抗体与SMCC反应的时候还没有加核酸，所以应该不是抗体和核酸的比例问题吧。我想过稀释抗体，但是抗体与SMCC反应之后我是用一个最大上样量12微升的脱盐柱除过量SMCC的，如果稀释太多实验的成本上耗不起啊
另外我想问一下，你知道为什么如果SMCC先和氨基的DNA反应，除盐之后再与抗体孵育，理论上不是也可以吗，为什么我的电泳显示一点也没有标上去？如果SMCC能让这个抗体产生这么严重的交联，它表面的巯基应该挺多的吧？

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5楼2017-10-02 20:58:40
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lvyongfeng
6楼2017-10-02 21:00:09
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sysg07124

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by minecat at 2017-10-02 20:42:32
全程在缓冲液中加入螯合剂EDTA试试。

请问加螯合剂的作用是什么？抗体与SMCC的反应我用的1X PBS，之后巯基DNA的还原和脱盐后与抗体的孵育缓冲液我都加了EDTA的

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7楼2017-10-02 21:00:51
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sysg07124

新虫 (初入文坛)
抗体与核酸共价连接，sulfo-SMCC做交联剂-1

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8楼2017-10-03 22:48:35
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sysg07124

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sysg07124 at 2017-10-03 22:48:35

第一条泳道是纯抗体对照，后面四个分别是四次标记的结果，后两个是不是就已经算标上了，好像这种连接本身的效率就不是很高？

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9楼2017-10-03 22:50:40
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wrxnyd54

木虫 (著名写手)
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10楼2017-10-04 02:16:54
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