请教一下连接与转化问题!
各位大侠你们好!我想请教一下一个问题,我现在做的是串联表达,我是先分别扩增两段长度一样的串联片段,并且串联片段的序列都是重复的,然后我在这两段串联片段设计一个相同的限制性内切酶,目的是通过这个酶把这两段串联的片段连接起来,这样的话,我串联的长度就延长了,我现在时扩增的两段片段也都扩出来了,两段片段的大小都是350bp左右,然后双酶切,第一段片段我用ECORI和Sal I双酶切,第二段我用Sal I和Xhol I双酶切,条带也都有,然后我把这两段双酶切回收的产物和PET-30a(+)载体双酶切【载体用ECORI,Xhol I双酶切回收】这三段我在一个体系里面连接,然后转化,但是最后我挑菌进行pcr鉴定扩出来的条带大小只有350bp多,按说连上应该是680bp多,双酶切鉴定也没有那条目的条带的条带,这样不是说我没连上吗,这样的话我应该怎样改进啊?请各位指导一下!谢谢!我以前做出来的一段串联片段也是按这种方法做的,测序也都正确! 返回小木虫查看更多
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如果你去测序,就会发现克隆到你的载体中的都是第一个片段(EcoRI+SalI),原因很简单,salI和XhoI是同粘酶(酶切后产生的粘性末端一样)。改进方法很简单:将XhoI或者SalI合成其他合适的酶就行了
将XhoI或者SalI换成其他合适的酶就行了
请教一下,末端一样就不可能出现第1,2连接后于载体连接的情况么?还是只是这种几率太低,基本做不出来
都忘了同粘酶的定义了,汗,赶紧搜了下:
同粘酶:
识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端。
刚看了下,Sal I和Xho I的位点最外面的一个碱基是不一样的啊,这两个就不算同粘酶了吧?
Xho I C|TCGAG
GAGCT|C
Sal I G|TCGAC
CAGCT|G
,
你要再多读几次定义.
Xho I的粘性末端是:TCGAG
Sal I 的粘性末端是: TCGAC
这两个不一样啊。请教啊。
我习惯叫同尾酶,粘末端都是TCGA呀.