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罗飞同学1993铁虫 (小有名气)
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巢式PCR阴性对照一直有条带，且跟我目的条带大小一致，怎么解决？已有1人参与
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巢式PCR： OUT即第一轮pcr（用F1 R2），目的条带714bp； IN即第二轮pcr（用F1 R4），目的条带606bp； 所用引物： Primer name Primer sequence (5’→3’) Reference : OIE (2009) SVCV F1 5’-TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC-3’ SVCV R2 5’-AGATGGTATGGACCCCAATACATHACNCAY-3’ SVCV R4 5’-CTGGGGTTTCCNCCTCAAAGYTGY-3’ PCR程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 cycles；72 ℃ 10 min 存在问题：用自来水、蒸馏水、高压灭菌后的无菌水作为模板后，P出了目的条带大小相同的条带。 排除因素： (1) 考虑到水污染、每次都换新的无菌水； (2)考虑到引物污染，重新合成了引物分装后进行实验（引物序列不变）； (3)考虑到MIX原因，每次实验都用新拆封的MIX（vazyme）； (4)考虑到人为操作原因，换人加样。结果，阴性对照还是出现了条带。 现在不知道怎么继续了，希望各位前辈多多指教，感激不尽！  10.31电泳图jpg.jpg  11.03电泳图jpg.jpg |
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【答案】应助回帖
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渊博震天: 金币+5, 鼓励回复经验交流 2018-11-11 10:44:12
罗飞同学1993: 金币+50, ★★★很有帮助 2018-11-12 09:08:18
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我觉得还是污染了。知道你已经做得很辛苦了，但这种pcr污染很常见。 建议：换试验台。每步必换手套。pcr产物跟pcrset up尽可能空间隔绝。 甚至换移液枪。反正各种变态防着污染 还有，每次打开pcr tube的盖子，都用不同手指，或者换手套 |
2楼2018-11-10 22:58:50
人生无遗憾
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- 专业: 水产生物免疫学与病害控制
3楼2022-10-16 13:31:03
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4楼2022-10-28 13:26:57
85
