为什么连接这么难呢?
做了很久的连接了,几乎总是失败。无论是用普通的T4酶连接,还是将片段PCR后用专门的PCR产物连接试剂盒连接;无论是用哪个公司的酶连接,总是连接不上,为什么呢?现在严重怀疑是自己的技术问题……
连接后转化大肠杆菌,阳性对照每次都可以长出来,就是自己的连接样品不长,无论是新配制的抗性平板,还是配制了大约一个月的抗性平板,都不长……所以我怀疑是自己的连接出了问题,不知道猜想对不对?求各位大侠赐教。
难道是连接后需要纯化吗?但是请教了别的实验室的人,都说一般不需要纯化,都是直接转化的呀~涂板时也注意将涂布器凉了再涂的呀,应该不会将细菌高温杀死了啊?也没敢涂的时间太久啊,大概每块板就两三分钟吧,也应该不会导致细菌死亡啊?……哪里的问题呢?
连接时的操作都需要注意些什么呢?跪求各位指点啊!跪求……
我这只大菜鸟……
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首先PCR后跑电泳检测,全部上样,割胶回收。然后连接。
连接我做了两组(均为TaKaRa产品):
1、 10xT4连接Buffer 1ul
pMD 18 T 载体 1ul
T4 DNA 连接酶 1ul
割胶回收PCR产物 7ul
2、 pMD 18 T 载体 1ul
割胶回收PCR产物 4ul
Solution 1 5ul
两者均为16摄氏度连接过夜,我还怕温度不准,放在了PCR仪里,取出来时看了时间,14个小时多,按理说肯定该连接好了。但是转化大肠杆菌后不长。
PCR我也是重新做的,就是想着用新鲜的PCR产物,载体是问别人借的,因为实验室正好用完了,但是别人每次都可以连接成功的……所以我就搞不懂是哪里的问题了,难道是我的酶有问题?
[ Last edited by 西瓜 on 2011-6-8 at 16:05 ] 返回小木虫查看更多
阳性对照ok的话,那连接出问题的可能比较大啦。建议你把连接步骤详细说下。
我们实验室的话,如果连接屡次不成,会直接重新做连接底物,PCR重做,载体也重新切。PCR产物用试剂盒纯化,载体酶切之后胶回收纯化,不过也有人上述两者都只是乙醇沉淀纯化,做得也很好。连接产物我们从来不纯化呢。
用Takara的试剂盒做连接,然后放到PCR仪里面,时间久点
还有就是要是你连续连接超过三次都不行的话最好考虑换酶,PCR和酶切的酶
我的也是连接了好久一直连接不上,但是最近换了PCR的酶之后很顺利,连着连接上两个,呵呵
pMD18-T vector ligation system
pMD18-T 1uL
DNA template 4uL
Solution I 5uL
Total 10uL
将纯化的PCR产物与T载体连接重组,16℃保温3~4h后,全量(10uL)转化至150uL的E.coli DH5α的感受态细胞。
(1) 将10μL连接液移入含200μL感受态细胞的1.5mL dorf管中,冰浴30-60min。
(2) 42℃水浴热激90sec后,立即再冰浴5min。
(3) 加入300μL LB液体培养基,37℃ 220 rpm培养1-2h。
(4) 吸100μL菌液涂布含Amp/ X-Gal/ IPTG平板培养基的LB固体培养基平板, 37℃ 培养16-24h。
保证PCR产物或感受态细胞的质量即可。
这个我怀疑是感受态细胞的质量或是转化步骤存在很大问题~
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顺便提一下
pMD18-T vector载体的链接效率很低,如果总是做不出来,可以用promega的T easy载体。
我一直用takara的PMD19-T,一般没出现过什么问题,在4度连接过夜,如果片段稍长,就多连接一天...
是不是你回收的目的基因不纯,有杂质会影响连接反应。