你合成的是双链，还是用两条引物退火而成
http://edu.muchong.com/attachment/9c/48/654839_1299721150_644.jpg
可以利用两个引物退火形成带粘端小片段，然后和载体连接

引用回帖:

2楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-04 19:08:59:
你合成的是双链，还是用两条引物退火而成
http://edu.muchong.com/attachment/9c/48/654839_1299721150_644.jpg
可以利用两个引物退火形成带粘端小片段，然后和载体连接

我还是有很多地方感觉不清楚，比如合成约25bpy引物，后面是用类似PCR的方法使其扩增？那酶，DNTP什么的要怎么解决？这么小怎么纯化？连接也会比较难呀。

不要扩增直接退火啊，你合成的引物浓度很高的，不用PCR扩增的

引用回帖:

4楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-05 10:26:17:
不要扩增直接退火啊，你合成的引物浓度很高的，不用PCR扩增的

有没有这个具体方法的文献或文章，技术路线什么的？

1.如果你合成的是两条单链，那么直接退火后就可以连接载体了，不过我现在很怀疑你的酶切位点处的序列设计的是否正确。如果可以把两条序列和酶切位点的名字传上来吧
2.如果你合成的是双链DNA，请确定你的酶切位点两端的保护碱基是否够用，最后每端有3个以上，然后酶切后连载体

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6楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-05 14:04:38:
1.如果你合成的是两条单链，那么直接退火后就可以连接载体了，不过我现在很怀疑你的酶切位点处的序列设计的是否正确。如果可以把两条序列和酶切位点的名字传上来吧
2.如果你合成的是双链DNA，请确定你的酶切位点 ...

我直接不用保护碱基，就是用酶切位点直接连载体，否则酶切还要处理很麻烦！给我留个邮箱吧，好交流些！

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5楼: Originally posted by jian520yi at 2011-08-05 10:59:14:
有没有这个具体方法的文献或文章，技术路线什么的？

技术路线很简单，引物回来稀释成100pmol/ul
两条各取2ul混匀成4ul，95度变性5min，慢退火（PCR 95度反应后直接停止关机，30分钟后拿出来放在室温）

连接体系就是4ul小片段＋载体（能达到300ng最好）＋T4bufffer&ligase
连接反应过夜～～

做了两次，一次是平端补平加酶切位点，一次是加his-tag，都成功了，只要小片段的酶切位点别设计错了就ok～
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