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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 请问为什么测序对了的重组质粒，双酶能切出其他条带
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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

[求助] 请问为什么测序对了的重组质粒，双酶能切出其他条带 已有4人参与

做表达做了快一年了一直没有表达出来，心里快急死了···

是一个pet30与目的基因的重组质粒，目的基因117bp，总共只有11kDa大小的氨基酸，尝试了多次诱导表达都不成功

测序没有问题（只测了T7启动子后的序列，加上插入的目的基因序列，跟给出的pet30序列图是完全相同的，翻译成氨基酸理论上也可以正常表达）

目前在找问题，发现酶切这个地方一直有问题没有解决

请问为什么测序对了的重组质粒，双酶能切出其他条带
这个是提取的质粒的照片
之后将此质粒转化入其他BL21和DH5a，测序也都正确；

请问为什么测序对了的重组质粒，双酶能切出其他条带-1
这个是将此质粒进行双酶切的电泳照片
请问为什么在1000多和3000多的地方也有条带呢？
按理说商业质粒不应该会有其他部位能切开的吧？请问这是什么原因呢？
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1楼 2015-12-25 10:30:24
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yoxue

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒双酶切的目的片段太小，因此质量就低，在电泳后带浅或看不清（或看不到）是很正常的

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5楼2015-12-27 13:31:34
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liuxinyueer

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.商业质粒查看质粒图谱、序列，EcoRI和XhoI切后明显有多条条带。
2.异源表达建议用偏好密码子
3.查看T7启动子是否在目的细胞中属于强启动子
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2楼2015-12-26 20:32:25
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从提取的质粒看质量不是很好，存在很多开环或线性质粒，试想一下线性质粒被单酶切有没有出现上述情况呢？
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生物科学
3楼2015-12-26 20:47:55
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你知道星号活性么，消化了多久？用的哪家的酶。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
4楼2015-12-27 11:36:40
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