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1楼 2015-08-25 10:20:14

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lcuwxy

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PCR条件需要优化

2楼2015-08-25 10:35:20

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晞朔

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请给出你的反应程序和反应体系

4楼2015-08-25 14:41:39

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肥猫p

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-25 22:43:54

marker看不出来，说明肯定是胶的问题。你融化琼脂糖的时候，试试延长一点加热时间，比如微波炉1min

5楼2015-08-25 20:55:06

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Z.Ada

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应该是胶的问题，我用的是1%，100V的，多做几次就好了，刚开始问题多正常，Fighting

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11楼2015-08-26 09:15:41

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jingmi

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呦呦奶茶: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢，果然是电压的问题 2015-08-26 22:03:09

marker都不行。估计是跑胶的事。电流电场有问题。重新配置缓冲液试试

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21楼2015-08-26 20:39:04

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lcuwxy

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你加了marker？哪条带是？如果加了marker也是这样子，就应该是跑胶的问题了。重新跑一下试试吧。另外提醒你一下，循环数不是越多越好的，我们试过循环数30和25，在我们P的那个基因以及条件下，25个循环甚至20个循环都可以出很漂亮的带，但是如果循环数加到30 ，就会出现很严重的拖尾，就跟你跑出来的样子似的。所以先排除跑胶的问题，跑胶加个阳参。如果不是跑胶的问题，再去优化条件。

25楼2015-08-26 22:37:36

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xiadongliang

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胶有问题吧。

3楼2015-08-25 14:10:18

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4楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-08-25 14:41:39
请给出你的反应程序和反应体系

体系是Mix12.5，引物各0.5微升，DNA模板1微升，最后定容到25微升，
反应过程我这个是94度5分钟，94度一分钟，退火温度是从56到62跑了个梯度，然后72度一分钟，35个循环，最后72度跑五分钟。
胶是2%的，电压80V非常感谢！！！

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6楼2015-08-26 00:13:44

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5楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-08-25 20:55:06
marker看不出来，说明肯定是胶的问题。你融化琼脂糖的时候，试试延长一点加热时间，比如微波炉1min

我们实验室只有一个电磁炉，我就在锅里烧些水，然后把锥形瓶放进去煮的，不知道是不是有影响？？但是应该也是完全溶解了。

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7楼2015-08-26 00:16:19

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2楼: Originally posted by lcuwxy at 2015-08-25 10:35:20
PCR条件需要优化

这个就是对退火温度做了梯度以后出来的图，也确实好没有摸清楚条件。。。

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8楼2015-08-26 00:19:48

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marker没出来，说明胶有问题，检查配胶电泳液，电泳槽电泳液换新的，煮胶让琼脂糖完全融化。

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只要想起一生中后悔的事，梅花便落满了南山。

9楼2015-08-26 01:02:09

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6楼: Originally posted by 呦呦奶茶 at 2015-08-26 00:13:44
体系是Mix12.5，引物各0.5微升，DNA模板1微升，最后定容到25微升，
反应过程我这个是94度5分钟，94度一分钟，退火温度是从56到62跑了个梯度，然后72度一分钟，35个循环，最后72度跑五分钟。
胶是2%的，电压80V非 ...

72延伸1分钟你的片段不小吧？是不是胶浓度太高了？

maker看不清可能是胶的问题，也可能是你上样有问题，你上了多少？